Подходы к визуализации динамики микротрубочек in vitro

https://doi.org/10.1038/nature04132

]

. Переключения с полимеризации (сборки) на деполимеризацию (разборку) называются «катастрофами», обратные переключения – «спасениями». Микротрубочки участвуют в поддержании формы клетки, обеспечивают её подвижность; они играют важную роль во внутриклеточном транспорте и в клеточном делении. Особенности внутренней организации микротрубочек и взаимодействия димеров тубулина друг с другом позволяют микротрубочкам развивать силы, необходимые в процессе распределения хромосом во время деления клетки

[

Force production by disassembling microtubules

E. Grishchuk, M. Molodtsov, F. Ataullakhanov, J. McIntosh

Nature. 2005, 438, 384-388

https://doi.org/10.1038/s41580-021-00399-x

Regulation of microtubule dynamics, mechanics and function through the growing tip

N. Gudimchuk, J. McIntosh

Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2021, 22, 777-795

https://doi.org/10.1038/s41467-020-17553-2

Mechanisms of microtubule dynamics and force generation examined with computational modeling and electron cryotomography

N. Gudimchuk, E. Ulyanov, E. O’Toole, C. Page, D. Vinogradov, G. Morgan, G. Li, J. Moore, E. Szczesna, A. Roll-Mecak, F. Ataullakhanov, J. Richard McIntosh

Nature Communications. 2020, 11, None

https://doi.org/10.1038/nrc1317

]

Микротрубочки имеют диаметр порядка 25 нм, состоят из димеров тубулина, нековалентно связанных друг с другом продольными и поперечными контактами. Толщина микротрубочки значительно меньше разрешающей способности световой микроскопии, в то время как её длина может сильно меняться и способна достигать многих микрометров. Тем не менее, современные методы световой микроскопии позволяют наблюдать за поведением отдельных микротрубочек и даже способны дать некоторые представления о самой их структуре.

Большой интерес к тубулиновым микротрубочкам вызван их жизненно важными функциями, среди которых распределение хромосом во время деления клетки занимает особое место. С этим связан тот факт, что одни из самых успешно применяемых в химиотерапии противоопухолевых препаратов подавляют динамическую нестабильность микротрубочек за счёт ингибирования белка тубулина

[

Microtubules as a target for anticancer drugs

M. Jordan, L. Wilson

Nature Reviews Cancer. 2004, 4, 253-265

https://doi.org/10.1083/jcb1686fta1

]

. Тем не менее, механизмы действия таких веществ в большинстве случаев изучены плохо. Кроме того, внутриклеточная среда биохимически очень сложна, в ней присутствуют, в том числе, разнообразные регуляторные белки, ассоциированные с микротрубочками, механизмы действия которых также не до конца понятны. Проведение эксперимента в искусственно воссозданных условиях с очищенным тубулином, а также при добавлении интересующих регуляторных молекул, позволяет упростить изучаемую систему и наиболее детально охарактеризовать поведение микротрубочек.

Микротрубочки изучаются более 50 лет с использованием различных методов. В 1963 году Слоттербек, Ледбеттер и Портер с помощью крио-электронной микроскопии дали полное описание тубулиновым полимерам, признали их повсеместность и назвали их “микротрубочками”

[

Microtubules get a name

Slautterback F, Ledbetter A.

Journal of Cell Biology. 2005, 168, 852-853

https://doi.org/10.1042/EBC20180031

]

. Рентгеноструктурный анализ и приблизившаяся к нему по разрешающей способности криоэлектронная микроскопия позволили в дальнейшем изучить строение отдельных молекул тубулина и их взаимодействие в составе микротрубочек на атомарном уровне

[

Microtubule structure by cryo-EM: snapshots of dynamic instability

S. Manka, C. Moores

Essays in Biochemistry. 2018, 62, 737-751

https://doi.org/10.1016/j.sbi.2015.12.009

Visualizing microtubule structural transitions and interactions with associated proteins

E. Nogales, R. Zhang

Current Opinion in Structural Biology. 2016, 37, 90-96

https://doi.org/10.1086/BBLv189n2p206

]

. Параллельно с этими исследованиями, совершенствование световой микроскопии и развитие новых методов контрастирования позволили наблюдать за поведением микротрубочек in vitro и in vivo с впечатляющим нанометровым разрешением.

Данный обзор посвящен основным методам микроскопии микротрубочек in vitro в контексте задач, которые решались в конкретных работах. Наблюдение за поведением микротрубочек и изучение их свойств в наиболее естественных условиях или, по крайней мере, приближенных к ним условиях in vitro эксперимента возможно с помощью, по крайней мере, двух разных физических подходов: световой и атомно-силовой микроскопий (АСМ). Эти подходы дают возможность взглянуть на микротрубочки на разных пространственных и временных масштабах. Сопоставить явления на этих масштабах необходимо для понимания механизмов динамического поведения тубулиновых полимеров. В течение последних более, чем 30 лет активных исследований динамической нестабильности микротрубочек, наиболее широко применялись различные методы световой микроскопии (Рис. 1). При этом в области изучения динамики тела микротрубочек, то есть её участка между двумя концами, атомно-силовая микроскопия начинает также активно использоваться наряду со световой микроскопией (Рис. 1). Поэтому в конце обзора мы рассмотрим оба подхода применительно к данной области исследований.

Надеюсь, что этот обзор окажется полезным для будущих исследований поведения микротрубочек и их свойств, обоснованного выбора метода микроскопии микротрубочек в различных экспериментальных постановках in vitro, в том числе, с использованием регуляторных молекул.

Количество работ, посвященных (или затрагивающих) изучение микротрубочек с помощью основных методов световой и атомно-силовой микроскопии, опубликованных к определённому моменту с 1977 по 2022 год. Сумма статей считалась с окном в 5 лет с помощью базы данных PubMed по запросам, включающим слова «microtubules» и название соответствующего метода микроскопии (флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения, «TIRF» (от англ. total internal reflection fluorescence), атомно-силовая микроскопия «АСМ», дифференциальная интерференционно-контрастная микроскопия («ДИК» или «DIC»), микроскопия тёмного поля или «dark-field».

Figure 1. Количество работ, посвященных (или затрагивающих) изучение микротрубочек с помощью основных методов световой и атомно-силовой микроскопии, опубликованных к определённому моменту с 1977 по 2022 год. Сумма статей считалась с окном в 5 лет с помощью базы данных PubMed по запросам, включающим слова «microtubules» и название соответствующего метода микроскопии (флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения, «TIRF» (от англ. total internal reflection fluorescence), атомно-силовая микроскопия «АСМ», дифференциальная интерференционно-контрастная микроскопия («ДИК» или «DIC»), микроскопия тёмного поля или «dark-field».

Световая микроскопия отдельных микротрубочек

Микротрубочки можно визуализировать множеством оптических методов, включая светлопольную, поляризационную микроскопию, флуоресцентную и другие

[

Quantifying Single and Bundled Microtubules with the Polarized Light Microscope

P. Tran, E. Salmon, R. Oldenbourg

The Biological Bulletin. 1995, 189, 206-206

https://doi.org/10.1119/1.3453264

10,

Visualizing individual microtubules by bright field microscopy

B. Gutiérrez-Medina, S. Block

American Journal of Physics. 2010, 78, 1152-1159

https://doi.org/10.1016/S0091-679X(10)95013-9

Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy

Christopher Gell, Volker Bormuth, Gary J. Brouhard, Daniel N. Cohen, Stefan Diez, Claire T. Friel, Jonne Helenius, Bert Nitzsche, Heike Petzold, Jan Ribbe, Erik Schäffer, Jeffrey H. Stear, Anastasiya Trushko, Vladimir Varga, Per O. Widlund, Marija Zanic, Jonathon Howard

Methods in Cell Biology. 2010, 95, 221-245

https://doi.org/10.1038/312237a0

]

. Однако в случае микроскопии светлого поля (Рис. 2 А) наибольший фоновый вклад возникает от самого поля освещения, что приводит к необходимости усреднения большого числа кадров одного и того же поля по времени для получение контрастного изображения микротрубочек, что несовместимо с изучением их динамической нестабильности. В таких исследованиях исторически важным было установление и подробный анализ фаз относительно медленной полимеризации и быстрой деполимеризации, сменяющих друг друга стохастическим образом

[

Dynamic instability of microtubule growth

T. Mitchison, M. Kirschner

Nature. 1984, 312, 237-242

Visualization of the dynamic instability of individual microtubules by dark-field microscopy

T. Horio, H. Hotani

Nature. 1986, 321, 605-607

https://doi.org/10.1016/0014-4827(76)90642-X

]

Метод тёмного поля

Один из наиболее простых способов улучшения контраста изображения биологического образца, получаемого с помощью световой микроскопии, основан на детектировании рассеянного на образце света за счет отделения его от сигнала фона, в чем заключается микроскопия тёмного поля (Рис. 2 Б). В работе

[

Shape of microtubules in solutions

T. Miki-Noumura, R. Kamiya

Experimental Cell Research. 1976, 97, 451-453

]

была продемонстрирована техническая возможность наблюдения отдельных микротрубочек с помощью темнопольной микроскопии и описана их прямая форма. Затем, 10 лет спустя, на основе этого метода впервые изучена динамическая нестабильность отдельных микротрубочек в системе с очищенным тубулином

[

12,

Visualization of the dynamic instability of individual microtubules by dark-field microscopy

T. Horio, H. Hotani

Nature. 1986, 321, 605-607

https://doi.org/10.1002/cm.970100127

Dynamics of microtubules visualized by darkfield microscopy: Treadmilling and dynamic instability

H. Hotani, T. Horio

Cell Motility and the Cytoskeleton. 1988, 10, 229-236

https://doi.org/10.1083/jcb.138.1.105

]

. После этого ключевого события в области изучения микротрубочек механизмы динамической нестабильности стали объектом всестороннего внимания со стороны биофизиков. Так, в работе

[

A Metastable Intermediate State of Microtubule Dynamic Instability That Differs Significantly between Plus and Minus Ends

P. Tran, R. Walker, E. Salmon

Journal of Cell Biology. 1997, 138, 105-117

https://doi.org/10.1016/0304-4165(83)90212-X

]

с помощью метода темного поля было установлено различие в динамике «плюс» и «минус» концов микротрубочек после того, как происходит отрезание их концевого участка, обогащённого ГТФ-связанными димерами тубулина (так называемой ГТФ-шапки), который, как считается, стабилизирует микротрубочку. Причем эти различия не связаны с типом затравок (то есть коротких стабильных фрагментов микротрубочек) для нуклеации микротрубочек и не зависят от того, какой способ — механический или фоторазрушающий — используется в эксперименте. Как пишут авторы, использование метода темного поля было обосновано необходимостью увеличения разрешения по глубине резкости, чтобы упростить визуализацию свободно колеблющихся концов микротрубочки.

Схема работы светлопольного и тёмнопольного микроскопа. A) Образец освещается с помощью источника через конденсор. Проходящий через образец свет частично им поглощается и рассеивается, на основе чего формируется изображение с помощью объектива. Б) Световой фронт от источника при прохождении через конденсор преобразуется установленным в него непрозрачным диском или затемнённой областью таким образом, что после попадания на образец он не может попасть в объектив напрямую. Вместо этого объектив детектирует сигнал, соответствующий рассеянному от образца свету.

Figure 2. Схема работы светлопольного и тёмнопольного микроскопа. A) Образец освещается с помощью источника через конденсор. Проходящий через образец свет частично им поглощается и рассеивается, на основе чего формируется изображение с помощью объектива. Б) Световой фронт от источника при прохождении через конденсор преобразуется установленным в него непрозрачным диском или затемнённой областью таким образом, что после попадания на образец он не может попасть в объектив напрямую. Вместо этого объектив детектирует сигнал, соответствующий рассеянному от образца свету.

Первые работы по описанию механических свойств микротрубочек так же были проведены с использованием темнопольной микроскопии. В статье

[

Flexural rigidity of singlet microtubules estimated from statistical analysis of their contour lengths and end-to-end distances

J. Mizushima-Sugano, T. Maeda, T. Miki-Noumura

Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1983, 755, 257-262

https://doi.org/10.1143/jjap.41.3015

]

было сфотографировано большое количество микротрубочек, произвольным образом иммобилизированных на поверхности покровного стекла, после чего измерены их контурные длины и расстояния между плюс и минус концами. На основе этих измерений и их интерпретации с помощью физической модели сделано заключение о том, что тело микротрубочки на порядок более устойчиво к изгибу и менее — к растяжению, по сравнению с нитью F-актина. В более поздней работе

[

Flexural Rigidity of a Single Microtubule

T. Takasone, S. Juodkazis, Y. Kawagishi, A. Yamaguchi, S. Matsuo, H. Sakakibara, H. Nakayama, H. Misawa

Japanese Journal of Applied Physics. 2002, 41, 3015-3019

https://doi.org/10.1529/biophysj.105.071324

]

жесткость микротрубочек при изгибе измеряли с использованием метода лазерного пинцета, для чего один конец микротрубочки был химически связан со стеклянной микросферой, в то время как другой её конец был связан с подложкой из кварцевого стекла. Захват микросферы лазером и манипулирование ею позволил вызвать три различных способа деформации микротрубочки (изгиб перпендикулярно оси микротрубочки, сжатие вдоль оси микротрубочки в режимах, когда сжимающая сила меньше критической нагрузки или больше неё). Эта работа, тем самым, показала возможность эффективной комбинации тёмнопольной микроскопии и лазерной микроманипуляции для исследования механических свойств в субмикрометровом масштабе.

Оригинальный пример изучения микротрубочек включает исследование их электростатических свойств, которые играют важную роль в во взаимодействии с ассоциированными с ними белками

[

Dielectric Measurement of Individual Microtubules Using the Electroorientation Method

I. Minoura, E. Muto

Biophysical Journal. 2006, 90, 3739-3748

https://doi.org/10.1247/csf.19.279

]

. Для этого авторы наблюдали за ориентацией микротрубочек в электрическом поле с помощью тёмнопольной микроскопии и описали их полиэлектролитную природу. Этот факт, в свою очередь, может объяснить физико-химическую основу неспецифических электростатических взаимодействий между микротрубочками и различными ассоциированными с ними белками.

Одна из первых работ, где изучалась динамическая нестабильность в присутствии регуляторных белков

[

Microtubule-Stabilizing Activity of Microtubule-Associated Proteins (MAPs) Is Due to Increase in Frequency of Rescue in Dynamic Instability: Shortening Length Decreases with Binding of MAPs onto Microtubules.

T. Itoh, H. Hotani

Cell Structure and Function. 1994, 19, 279-290

]

основывалась на протоколе из статьи

[

Visualization of the dynamic instability of individual microtubules by dark-field microscopy

T. Horio, H. Hotani

Nature. 1986, 321, 605-607

https://doi.org/10.1021/bi00198a017

]

. Благодаря такому исследованию было выяснено, что неочищенные белки, ассоциированные с микротрубочками и, в частности, так называемый белок MAP2 вызывают повторные спасения микротрубочек. В том же году был исследован другой регуляторный τ-белок, который был одним из первых обнаруженных белков, ассоциированных с микротрубочками и охарактеризованных биохимически. Интерес к нему был значительно усилен открытием того факта, что τ-белок является основным компонентом парных спиральных нитей при болезни Альцгеймера и что патологический вариант τ-белка аномально фосфорилирован. В статье

[

Domains of tau Protein and Interactions with Microtubules

N. Gustke, B. Trinczek, J. Biernat, E. Mandelkow, E. Mandelkow

Biochemistry. 1994, 33, 9511-9522

https://doi.org/10.1007/978-1-0716-0219-5_4

]

исследовался вопрос о том, как домены этого белка влияют на его взаимодействие с микротрубочками. Различные конструкции τ-белка, отличающиеся составом доменов, были исследованы на предмет их взаимодействия с микротрубочками несколькими независимыми методами, среди которых тёмнопольная микроскопия использовалась для изучения образующихся пучков микротрубочек.

В настоящее время метод темного поля продолжает использоваться, но применяется реже, чем альтернативные методы (Рис. 1), вероятно, поскольку требует повышенной чистоты приготовления образцов для визуализации микротрубочек. Это связано с тем, что метод темного поля позволяет детектировать рассеяние даже от небольших посторонних загрязняющих поле зрения объектов, таких как агрегаты белков, потому что контраст изображения данных объектов квадратично возрастает в зависимости от их размеров. Тем не менее, успешное изучение динамики микротрубочек in vitro с помощью тёмнопольной микроскопии можно реализовать, например, по протоколу из недавней работы

[

In Vitro Microtubule Dynamics Assays Using Dark-Field Microscopy

Spector JO, Vemu A, Roll-Mecak A.

Methods in Molecular Biology. 2020, 2101, 39-51

https://doi.org/10.1002/cm.970010302

]

Метод дифференциального интерференционного контраста

Второй принцип улучшения контраста биологических образцов при их световой микроскопии основан на детектировании интерференционной составляющей результирующего сигнала. Дифференциальная интерференционно-контрастная микроскопия (DIC) вместе с интерференционной микроскопией отражённого света (IRM) основаны на этом принципе.

Реализация метода DIC включает использование двух линейно поляризованных в ортогональных направлениях лучей, опорного и вспомогательного, пространственно сдвинутых друг относительно друга на небольшое расстояние, обычно несколько меньшее, чем радиус диска Эйри. Для этого используются специальные призмы (Волластона, Номарского), которые, как показано на Рис. 3, располагаются в оптической схеме после поляризатора и перед анализатором.

Схема работы DIC-микроскопа. Луч света от источника сначала проходит через поляризатор и становится линейно поляризованным. Затем, после прохождения через специальную призму (Волластона или Номарского), этот луч расщепляется на два параллельных луча, имеющих ортогональные направления поляризации. Детектирование гетерогенности оптической плотности образца осуществляется за счет того, что прошедшие через него в разных точках лучи приобретают относительную задержку фазы. Затем, после прохождения через вторую призму, лучи интерферируют друг с другом и приобретают, в общем случае, эллиптическую поляризацию. Стоящий за этой призмой анализатор снова преобразует луч в линейно поляризованный. Однако теперь его интенсивность зависит от взаимной ориентации поляризатора и анализатора, а также от гетерогенности оптической плотности образца в точках, через которые прошли лучи.

Figure 3. Схема работы DIC-микроскопа. Луч света от источника сначала проходит через поляризатор и становится линейно поляризованным. Затем, после прохождения через специальную призму (Волластона или Номарского), этот луч расщепляется на два параллельных луча, имеющих ортогональные направления поляризации. Детектирование гетерогенности оптической плотности образца осуществляется за счет того, что прошедшие через него в разных точках лучи приобретают относительную задержку фазы. Затем, после прохождения через вторую призму, лучи интерферируют друг с другом и приобретают, в общем случае, эллиптическую поляризацию. Стоящий за этой призмой анализатор снова преобразует луч в линейно поляризованный. Однако теперь его интенсивность зависит от взаимной ориентации поляризатора и анализатора, а также от гетерогенности оптической плотности образца в точках, через которые прошли лучи.

После изобретения DIC-микроскопии как таковой, важным событием для всех последующих исследований микротрубочек была разработка метода, позволяющего получить улучшенное изображение образцов с помощью оптимизаций, предложенных независимо друг от друга двумя командами Роберта Аллена и Шинья Иноуэ

[

22,

Video-enhanced contrast polarization (AVEC-POL) microscopy: A new method applied to the detection of birefringence in the motile reticulopodial network of allogromia laticollaris

R. Allen, J. Travis, N. Allen, H. Yilmaz

Cell Motility. 1981, 1, 275-289

https://doi.org/10.1002/cm.970010303

23,

Video-enhanced contrast, differential interference contrast (AVEC-DIC) microscopy: A new method capable of analyzing microtubule-related motility in the reticulopodial network of allogromia laticollaris

R. Allen, N. Allen, J. Travis

Cell Motility. 1981, 1, 291-302

https://doi.org/10.1083/jcb.89.2.346

Video image processing greatly enhances contrast, quality, and speed in polarization-based microscopy.

S. Inoué

Journal of Cell Biology. 1981, 89, 346-356

https://doi.org/10.1016/S0962-8924(00)88979-5

]

. Эти оптимизации затрагивали как саму оптическую схему, так и обработку изображения для получения изображения микротрубочек с высоким контрастом, что не могло быть достигнуто при наблюдении их через окуляр

[

VE-DIC light microscopy and the discovery of kinesin

E. Salmon

Trends in Cell Biology. 1995, 5, 154-158

https://doi.org/10.1083/jcb.107.4.1437

]

, как, например, в случае тёмнопольной микроскопии. Параметры динамической нестабильности микротрубочек (скорости полимеризации, деполимеризации, частоты катастроф и спасений) были впервые подробно охарактеризованы в работе

[

Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies.

R. Walker, E. O'Brien, N. Pryer, M. Soboeiro, W. Voter, H. Erickson, E. Salmon

Journal of Cell Biology. 1988, 107, 1437-1448

https://doi.org/10.1142/9789812790866_0048

]

с использованием DIC микроскопии. В следующей работе группы Салмона

[

Asymmetric behavior of severed microtubule ends after ultraviolet-microbeam irradiation of individual microtubules in vitro

Walker RA, Inoué S, Salmon ED.

Collected Works of Shinya Inoué. 2008, 108, 649-56

https://doi.org/10.1083/jcb.138.1.105

]

впервые была проверена гипотеза о том, что исчезновение ГТФ-шапки на конце микротрубочки должно привести к её быстрой деполимеризации. Для этого авторы использовали DIC микроскопию, которая позволила в реальном времени наблюдать за отрезанием плюс-концевых участков микротрубочек с помощью ультрафиолетового луча. Призма Волластона, используемая авторами, пропускала достаточное количество ультрафиолетового излучения для того, чтобы можно было реализовать эту процедуру при трёхсекундной экспозиции. Тем не менее, в аналогичных экспериментах с минус-концами микротрубочек не наблюдалась их быстрая деполимеризация. Наоборот, минус-конец продолжал расти с обычной скоростью после воздействия на него ультрафиолетом. Тем самым, эти фундаментальные работы не только охарактеризовали динамическое поведение микротрубочек, но и продемонстрировали различие в динамической нестабильности плюс- и минус-концов микротрубочки. Позднее, в работе

[

A Metastable Intermediate State of Microtubule Dynamic Instability That Differs Significantly between Plus and Minus Ends

P. Tran, R. Walker, E. Salmon

Journal of Cell Biology. 1997, 138, 105-117

https://doi.org/10.1002/(SICI)1097-0169(1997)38:3<278::AID-CM6>3.0.CO;2-1

]

было показано, что отличие в поведении обоих концов микротрубочки не связано с артефактами использования ультрафиолетового излучения для отрезания её концевых участков. В данном случае механический элемент, осуществляющий отрезание, так же визуализировался с помощью DIC микроскопии, и, ожидаемо, создавал сильную засветку, которую, тем не менее, удалось минимизировать в направлении тела микротрубочки за счет соответствующей ориентации видеокамеры.

Изучение микротрубочек из растительного тубулина с помощью DIC микроскопии в работе

[

In vitro assembled plant microtubules exhibit a high state of dynamic instability

R. Moore, M. Zhang, L. Cassimeris, R. Cyr

Cell Motility and the Cytoskeleton. 1997, 38, 278-286

https://doi.org/10.1021/bi00480a014

]

позволило выяснить, что они более динамичные по сравнению с микротрубочками животных. Это проявляется в большей частоте катастроф и отсутствии спасений при одинаковой скорости роста.

Затем начали появляться работы с использованием DIC микроскопии, в которых изучалась не только природа динамической нестабильности микротрубочек, но и механизмов её регуляции. К тому времени уже было известно, что параметры динамической нестабильности микротрубочек внутри клеток сильно отличаются от тех, что наблюдаются в системе с очищенным тубулином. Пролить свет на этот феномен смогли in vitro эксперименты, в которых изучалось влияние отдельных факторов на динамическую нестабильность. Одна из первых таких работ

[

Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules

E. O'Brien, E. Salmon, R. Walker, H. Erickson

Biochemistry. 1990, 29, 6648-6656

https://doi.org/10.1073/pnas.95.7.3661

]

позволила установить эффекты ионов магния на динамическую нестабильность микротрубочек. Измерение скоростей деполимеризации, вызванной холодом или ионами кальция, было произведено в работе

[

Structural changes at microtubule ends accompanying GTP hydrolysis: Information from a slowly hydrolyzable analogue of GTP, guanylyl (α,β)methylenediphosphonate

T. Müller-Reichert, D. Chrétien, F. Severin, A. Hyman

Proceedings of the National Academy of Sciences. 1998, 95, 3661-3666

https://doi.org/10.1093/hmg/8.9.1599

]

в рамках изучения структурных изменений белка тубулина в результате гидролиза ГТФ в его составе.

В клетке одними из основных регуляторов динамики микротрубочек являются ассоциированные с ними белки. Например, белок даблкортин, нарушения в работе которого приводят к некоторым заболеваниям мозга, был изучен в работе

[

Doublecortin, a Stabilizer of Microtubules

D. Horesh, T. Sapir, F. Francis, S. Grayer Wolf, M. Caspi, M. Elbaum, J. Chelly, O. Reiner

Human Molecular Genetics. 1999, 8, 1599-1610

https://doi.org/10.1083/jcb.127.4.985

]

. Авторы показали способность этого белка взаимодействовать с микротрубочками, стабилизировать их и приводить к образованию из них пучков in vitro. В работе

[

XMAP from Xenopus eggs promotes rapid plus end assembly of microtubules and rapid microtubule polymer turnover.

R. Vasquez, D. Gard, L. Cassimeris

Journal of Cell Biology. 1994, 127, 985-993

https://doi.org/10.1074/jbc.M114.584300

]

обнаружена удивительная способность белка XMAP215 из экстракта яиц Xenopus значительно увеличивать скорость полимеризации и деполимеризации плюс-концов микротрубочек, а так же подавлять их спасения, что резко отличалось от эффектов воздействия остальных изученных к тому времени ассоциированных белков. Гомолог XMAP215/Dis1, найденный в почкующихся дрожжах, способствует сборке микротрубочек, увеличивая скорость их роста и уменьшая частоту катастроф

[

Stu2, the Budding Yeast XMAP215/Dis1 Homolog, Promotes Assembly of Yeast Microtubules by Increasing Growth Rate and Decreasing Catastrophe Frequency

M. Podolski, M. Mahamdeh, J. Howard

Journal of Biological Chemistry. 2014, 289, 28087-28093

https://doi.org/10.1126/science.1064629

]

. Примечательно, что авторы исследовали взаимодействие белка Stu2 не только с микротрубочками, состоящими из свиного тубулина, но и из тубулина cамих почкующихся дрожжей. Так как выход такого тубулина в процессе очистки был небольшим, авторы использовали DIC микроскопию вместо флуоресцентной.

Комбинация двух различных белков, включающая стабилизирующий белок XMAP215 и дестабилизирующий микротрубочки кинезин (XKCM1) вместе с очищенным тубулином позволили воссоздать основные особенности физиологической динамики микротрубочек (более быструю полимеризацию и более частые катастрофы и спасения), наблюдение чего было проведено с помощью DIC микроскопии

[

Reconstitution of Physiological Microtubule Dynamics Using Purified Components

K. Kinoshita, I. Arnal, A. Desai, D. Drechsel, A. Hyman

Science. 2001, 294, 1340-1343

https://doi.org/10.1529/biophysj.104.055483

]

. Это был один из первых крупных шагов к пониманию сложных внутриклеточных процессов, зависящих от динамики микротрубочек, включающих, в том числе, сегрегацию хромосом.

Важная работа по изучению механических свойств микротрубочек

[

Flexural Rigidity of Individual Microtubules Measured by a Buckling Force with Optical Traps

M. Kikumoto, M. Kurachi, V. Tosa, H. Tashiro

Biophysical Journal. 2006, 90, 1687-1696

https://doi.org/10.1083/jcb.20.2.199

]

позволила с помощью DIC микроскопии и совмещённой с ней системы оптической ловушки измерить жесткость микротрубочек. Авторы сравнили результаты для микротрубочек, стабилизированных с помощью ингибитора динамики микротрубочек вещества таксол или медленно гидролизуемого аналога ГТФ — гуанозин-5'-[(α,β)-метилено]трифосфата (GMPCPP). Оказалось, что GMPCPP-микротрубочки примерно в 4 раза более жесткие. Эти результаты согласуются с аналогичными измерениями, проведёнными с помощью атомно-силовой микроскопии (ниже).

Интерференционная микроскопия отраженного света

Данный метод микроскопии, также известный под аббревиатурой IRM (от англ.: interference reflection microscopy), был изобретен в 1960-х годах

[

THE MECHANISM OF ADHESION OF CELLS TO GLASS

A. Curtis

Journal of Cell Biology. 1964, 20, 199-215

https://doi.org/10.1039/c7sc04733a

]

. Изначально применяемый для измерения небольшого расстояния между двумя плоскими поверхностями стеклянной подложки и для наблюдения нижней стороны прикреплённых к подложке клеток, сейчас он активно используется, в том числе, для изучения динамики микротрубочек. В настоящее время в некоторых работах название IRM используется как синоним современным оптимизированным методам, объединённым аббревиатурой RICM (отражательная интерференционно-контрастная микроскопия)

[

37,

Label-free and live cell imaging by interferometric scattering microscopy

J. Park, I. Lee, H. Moon, J. Joo, K. Kim, S. Hong, M. Cho

Chemical Science. 2018, 9, 2690-2697

https://doi.org/10.1038/s41563-020-00905-0

Self-repair protects microtubules from destruction by molecular motors

S. Triclin, D. Inoue, J. Gaillard, Z. Htet, M. DeSantis, D. Portran, E. Derivery, C. Aumeier, L. Schaedel, K. John, C. Leterrier, S. Reck-Peterson, L. Blanchoin, M. Théry

Nature Materials. 2021, 20, 883-891

https://doi.org/10.3791/59520

]

. В IRM изображение формируется за счет интерференции между светом, отраженным от границы раздела стекло-среда, и светом, отраженным от границы раздела среда-образец (Рис. 4).

Схема работы микроскопии отражённого света (IRM) [39]. A) Оптическая схема, включающая источник света и полупроницаемое зеркало (50/50), установленное вместо дихроического. Б) Такая схема позволяет освещать образец через объектив и, одновременно, детектировать сигнал интерференции между лучами отраженным от границы раздела стекло-среда и границы раздела среда-образец. Образец схематически представлен микротрубочкой, прикреплённой к заблокированной поверхности покровного стекла через антитела.

Figure 4. Схема работы микроскопии отражённого света (IRM) [39]. A) Оптическая схема, включающая источник света и полупроницаемое зеркало (50/50), установленное вместо дихроического. Б) Такая схема позволяет освещать образец через объектив и, одновременно, детектировать сигнал интерференции между лучами отраженным от границы раздела стекло-среда и границы раздела среда-образец. Образец схематически представлен микротрубочкой, прикреплённой к заблокированной поверхности покровного стекла через антитела.

Простой и относительно дешевый способ реализации IRM микроскопии подразумевает включение 50/50 зеркала вместо дихроического во флуоресцентный микроскоп, и, при соответствующих настройках микроскопа, такая система позволяет получить изображение с отношением сигнал/шум, аналогичным DIC и флуоресцентной микроскопии (Рис. 4)

[

39,

Implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules

Mahamdeh M, Howard J

J. Vis. Exp. 2019, 2019, 1-8

https://doi.org/10.1111/jmi.12744

Label-free high-speed wide-field imaging of single microtubules using interference reflection microscopy

M. MAHAMDEH, S. SIMMERT, A. LUCHNIAK, E. SCHÄFFER, J. HOWARD

Journal of Microscopy. 2018, 272, 60-66

https://doi.org/10.48550/arXiv.2201.07911

]

. Кроме того, на основе этого подхода можно легко реализовать одновременное наблюдение отдельных молекул, взаимодействующих с микротрубочкой, с помощью флуоресцентной микроскопии

[

Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins by Simultaneous Interference-Reflection and Total-Internal-Reflection-Fluorescence Microscopy

Tuna, Yazgan & Al-Hiyasat, Amer & Howard, Jonathon

None. 2022, None, None

https://doi.org/10.1073/pnas.1818824116

]

. Этот метод был применён той же группой в работах

[

42,

Spastin is a dual-function enzyme that severs microtubules and promotes their regrowth to increase the number and mass of microtubules

Y. Kuo, O. Trottier, M. Mahamdeh, J. Howard

Proceedings of the National Academy of Sciences. 2019, 116, 5533-5541

https://doi.org/10.1101/2022.03.28.486117

The force required to remove tubulin from the microtubule lattice

Kuo Y-W, Mahamdeh M, Tuna Y, Howard J

BioRxiv. 2022, None, None

https://doi.org/10.1073/pnas.1818824116

]

. Статья

[

Spastin is a dual-function enzyme that severs microtubules and promotes their regrowth to increase the number and mass of microtubules

Y. Kuo, O. Trottier, M. Mahamdeh, J. Howard

Proceedings of the National Academy of Sciences. 2019, 116, 5533-5541

https://doi.org/10.3791/59520

]

посвящена изучению парадокса, связанного с активностью рассекающие микротрубочки ферментов — спастина, катанина, фитжетина. Этот парадокс заключается в том, что ингибирование этих ферментов in vivo фактически уменьшает, а не увеличивает количество микротрубочек, что можно было бы ожидать на основании их способности разрушать микротрубочки. С помощью IRM авторы смогли установить выраженную способности спастина стабилизировать микротрубочки за счёт уменьшения скорости деполимеризаии и увеличения частоты спасений.

Другие научные группы тоже начинают использовать IRM микроскопию по протоколу из работы

[

Implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules

Mahamdeh M, Howard J

J. Vis. Exp. 2019, 2019, 1-8

https://doi.org/10.1002/cm.21681

]

. В статье

[

Single depolymerizing and transport kinesins stabilize microtubule ends

A. Ciorîță, M. Bugiel, S. Sudhakar, E. Schäffer, A. Jannasch

Cytoskeleton. 2021, 78, 177-184

https://doi.org/10.1016/j.devcel.2021.05.005

]

для изучения способности отдельных молекул кинезина вызывать деполимеризацию микротрубочек был сделан выбор в пользу IRM из-за необходимости проведения длительных записей процесса медленной деполимеризации микротрубочек, стабилизированных с помощью GMPCPP. В работе

[

α-tubulin tail modifications regulate microtubule stability through selective effector recruitment, not changes in intrinsic polymer dynamics

J. Chen, E. Kholina, A. Szyk, V. Fedorov, I. Kovalenko, N. Gudimchuk, A. Roll-Mecak

Developmental Cell. 2021, 56, 2016-2028.e4

https://doi.org/10.1016/j.bpj.2021.11.2743

]

с помощью IRM изучались эффекты C-концевого хвоста α-мономера тубулина на динамику микротрубочки, а в работе

[

Measurements and simulations of microtubule growth imply strong longitudinal interactions and reveal a role for GDP on the elongating end

J. Cleary, T. Kim, A. Cook, W. Hancock, L. Rice

Biophysical Journal. 2022, 121, 521a

https://doi.org/10.1016/j.devcel.2022.02.001

]

IRM позволила добиться высокого временного разрешения (10 кадров/с) и отношения сигнал к шуму на протяжении длительного времени съёмки благодаря отсутствию флуоресцентных красителей. Это было важно для изучения слабовыраженных флуктуаций в скоростях роста микротрубочек, которые, как считают авторы, зависят от нуклеотидного состояния димеров тубулина на её конце. Такое же преимущество IRM по сравнению с флуоресцентной микроскопией было использовано в работе

[

Physical properties of the cytoplasm modulate the rates of microtubule polymerization and depolymerization

A. Molines, J. Lemière, M. Gazzola, I. Steinmark, C. Edrington, C. Hsu, P. Real-Calderon, K. Suhling, G. Goshima, L. Holt, M. Thery, G. Brouhard, F. Chang

Developmental Cell. 2022, 57, 466-479.e6

https://doi.org/10.1126/sciadv.abm2225

]

, где изучалась зависимость динамики микротрубочки от концентрации цитоплазматического раствора. IRM позволила провести более точные измерения быстрых скоростей деполимеризации микротрубочек при разных вязкостях раствора в условиях in vitro.

Изучение полимеризации тубулина архей также возможно с помощью IRM. В отличие от редких, прямых, плавно удлиняющихся микротрубочек из тубулина эукариот, тубулин Odin, как показано в работе

[

Structure and dynamics of Odinarchaeota tubulin and the implications for eukaryotic microtubule evolution

C. Akıl, S. Ali, L. Tran, J. Gaillard, W. Li, K. Hayashida, M. Hirose, T. Kato, A. Oshima, K. Fujishima, L. Blanchoin, A. Narita, R. Robinson

Science Advances. 2022, 8, None

https://doi.org/10.1042/EBC20180035

]

имеет тенденцию образовывать более широкие пучки нитей при аналогичных условиях.

На фоне большого количества преимуществ метода, недостатком является ограниченность зоны наблюдения микротрубочек сравнительно тонким слоем у поверхности стекла. Это проявляется в том, что при удалении микротрубочек вглубь раствора контрастность изображения теряется.

Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения

Безусловно, одним из наиболее популярных методов визуализации микротрубочек является флуоресцентная микроскопия. Стабилизированные микротрубочки могут наблюдаться при помощи наиболее простых методов широкопольной флуоресцентной микроскопии, при условии, что на тубулины нанесены флуоресцентные метки, например, в виде малых органических красителей, флуоресцентно меченных анти-тубулиновых антител или белков, связывающих тубулины, или флуоресцентных белковых фрагментов, генетически присоединенных к тубулинам. Однако наблюдение динамической нестабильности подразумевает присутствие флуоресцентно-меченных тубулинов в растворе, которые создают существенный флуоресцентный фон, снижающий контраст изображения микротрубочек. Поэтому применяются методы, позволяющие собирать сигнал из довольно узкой зоны вокруг микротрубочек, и таким образом, значительно повышающие контраст. К таким методам относится конфокальная микроскопия и флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения (TIRF). Последний метод является в настоящее время, возможно, наиболее распространенным подходом для визуализации микротрубочек in vitro.

Метод TIRF-микроскопии (Рис. 5) позволяет изучать образцы в тонком слое (порядка 200 нм) вблизи поверхности покровного стекла. Для возбуждения флуоресценции образца свет должен пройти через границу между покровным стеклом и образцом. Обычно показатель преломления образца или среды, в которой он находится, меньше показателя преломления стекла. В таком случае складываются условия для возникновения явления полного внутреннего отражения, приводящие к тому, что луч, падающий на стекло под углами большими, чем угол полного внутреннего отражения, не проходит в среду с образцом. Тем не менее, экспоненциально затухающее электромагнитное поле обнаруживается в среде с образцом, причем его частота такая же, как у падающей волны. Применительно к микротрубочкам это позволяет изучать их в присутствии свободного флуоресцентно меченного тубулина и других молекул вблизи поверхности покровного стекла с высоким контрастом из-за отсутствия фона от толщи раствора.

Принцип работы флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF-микроскопия). A) Оптическая схема флуоресцентного микроскопа. Возбуждающий флуоресценцию луч (зелёный) освещает образец через объектив. Сигнал флуоресценции (красный) отделяется от сигнала возбуждающего луча с помощью дихроического зеркала и фильтров, установленных в кубике. Б) Показано освещение образца возбуждающим лучом под углом полного внутреннего отражения и детектирование сигнала от флуоресцентного тубулина (красный), присоединяющегося к концам микротрубочки и непосредственно в её тело. Образец схематически представлен микротрубочкой, прикреплённой к заблокированной поверхности покровного стекла через антитела.

Figure 5. Принцип работы флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF-микроскопия). A) Оптическая схема флуоресцентного микроскопа. Возбуждающий флуоресценцию луч (зелёный) освещает образец через объектив. Сигнал флуоресценции (красный) отделяется от сигнала возбуждающего луча с помощью дихроического зеркала и фильтров, установленных в кубике. Б) Показано освещение образца возбуждающим лучом под углом полного внутреннего отражения и детектирование сигнала от флуоресцентного тубулина (красный), присоединяющегося к концам микротрубочки и непосредственно в её тело. Образец схематически представлен микротрубочкой, прикреплённой к заблокированной поверхности покровного стекла через антитела.

Многочисленные примеры применения TIRF микроскопии для изучения динамики концов микротрубочек отражены в работе

[

Measuring microtubule dynamics

A. Zwetsloot, G. Tut, A. Straube

Essays in Biochemistry. 2018, 62, 725-735

https://doi.org/10.1038/ncb3406

]

. Я же в данном обзоре сосредоточусь на сравнительно недавнем применении этого метода для анализа феномена обмена тубулинов между телом микротрубочки и раствором

[

50,

Self-repair promotes microtubule rescue

C. Aumeier, L. Schaedel, J. Gaillard, K. John, L. Blanchoin, M. Théry

Nature Cell Biology. 2016, 18, 1054-1064

https://doi.org/10.1016/j.cub.2016.10.048

51,

Localized Mechanical Stress Promotes Microtubule Rescue

H. de Forges, A. Pilon, I. Cantaloube, A. Pallandre, A. Haghiri-Gosnet, F. Perez, C. Poüs

Current Biology. 2016, 26, 3399-3406

https://doi.org/10.1126/science.aau1504

Severing enzymes amplify microtubule arrays through lattice GTP-tubulin incorporation

A. Vemu, E. Szczesna, E. Zehr, J. Spector, N. Grigorieff, A. Deaconescu, A. Roll-Mecak

Science. 2018, 361, None

https://doi.org/10.1091/mbc.E16-05-0271

]

. Среди причин феномена такого встраивания ГТФ-тубулинов можно выделить повреждения решетки микротрубочки из-за механических деформаций изгиба, фотоиндуцированные дефекты, а так же дефекты, вызванные рассекающими микротрубочки ферментами. Кроме того, изменение количества протофиламентов в теле микротрубочки, а так же локальная смена типа её решетки присущи образующимся in vitro микротрубочкам. Тем не менее, внутри клетки эти явления каким-то образом могут контролироваться и регулироваться

[

53,

A microtubule bestiary: structural diversity in tubulin polymers

S. Chaaban, G. Brouhard

Molecular Biology of the Cell. 2017, 28, 2924-2931

https://doi.org/10.1101/2021.07.14.452321

Structural heterogeneity of the microtubule lattice

Guyomar C, Ku S, Heumann J, Bousquet C, Guilloux G, Gaillard N, et al

BioRxiv. 2021, None, None

https://doi.org/10.1038/s41567-019-0542-4

]

В работах

[

55,

Lattice defects induce microtubule self-renewal

L. Schaedel, S. Triclin, D. Chrétien, A. Abrieu, C. Aumeier, J. Gaillard, L. Blanchoin, M. Théry, K. John

Nature Physics. 2019, 15, 830-838

https://doi.org/10.1038/nmat4396

Microtubules self-repair in response to mechanical stress

L. Schaedel, K. John, J. Gaillard, M. Nachury, L. Blanchoin, M. Théry

Nature Materials. 2015, 14, 1156-1163

https://doi.org/10.1126/science.aau1504

]

изучалось влияние дефектов в теле микротрубочки на её механические свойства. Было обнаружено, что жесткость микротрубочки уменьшается с каждым циклом изгиба её тела. В данном случае изгиб тела микротрубочки осуществлялся под действием потока раствора буфера в направлении, перпендикулярном оси микротрубочки. Подобно другим случаям усталости материала, концентрация механических напряжений в местах предсуществующих дефектов приводит к образованию более крупных повреждений, снижающих жесткость микротрубочек. Тем не менее, в присутствии свободного ГТФ-тубулина поврежденные микротрубочки смогли включить новые димеры тубулина в свою решетку и восстановить первоначальную жесткость. Эти результаты показывают, что микротрубочки являются пластичными материалами со свойствами самовосстановления, то есть они обладают динамикой не только на своих концах. Такая пластичность решетки микротрубочек, как считается, позволяет им адаптироваться к механическим нагрузкам внутри клетки.

В работе

[

Severing enzymes amplify microtubule arrays through lattice GTP-tubulin incorporation

A. Vemu, E. Szczesna, E. Zehr, J. Spector, N. Grigorieff, A. Deaconescu, A. Roll-Mecak

Science. 2018, 361, None

https://doi.org/10.1016/S0006-3495(95)79953-2

]

применение TIRF микроскопии в комбинации с электронной микроскопией позволило визуализировать встраивание тубулина из раствора в места дефектов, вызванных регуляторными белками спастин и катанин. На основе этого была выдвинута гипотеза, впервые объясняющая парадокс, связанный с рассекающими микротрубочки белками, о котором было сказано выше. Согласно ей, наноразмерные повреждения по всей длине микротрубочки, вызванные этими белками, могут спонтанно восстанавливаться за счет включения ГТФ-тубулина из раствора прямо в тело микротрубочки. Это, в свою очередь, приводит к её стабилизации. Кроме того, концы микротрубочек, появляющиеся в результате разрыва в местах дефектов, должны быть обогащены ГТФ-тубулином, что предотвращает их деполимеризацию в соответствие с теорией о ГТФ-шапке. В конечном счёте, считают авторы, стабилизация разорванных плюс-концов и более высокая частота восстановления всей микротрубочки синергируют, увеличивая количество и массу микротрубочек.

Возможная связь между структурными особенностями тела микротрубочки и её динамической нестабильностью рассматривается во многих работах для объяснения так называемого феномена «старения». Он заключается в том, что вероятность катастроф микротрубочек возрастает с увеличением времени её полимеризации

[

57,

Kinetics of microtubule catastrophe assessed by probabilistic analysis

D. Odde, L. Cassimeris, H. Buettner

Biophysical Journal. 1995, 69, 796-802

https://doi.org/10.1016/j.cell.2011.10.037

Depolymerizing Kinesins Kip3 and MCAK Shape Cellular Microtubule Architecture by Differential Control of Catastrophe

M. Gardner, M. Zanic, C. Gell, V. Bormuth, J. Howard

Cell. 2011, 147, 1092-1103

https://doi.org/10.1073/pnas.2112261118

]

. Кроме того, в недавней работе

[

Lattice defects induced by microtubule-stabilizing agents exert a long-range effect on microtubule growth by promoting catastrophes

A. Rai, T. Liu, E. Katrukha, J. Estévez-Gallego, S. Manka, I. Paterson, J. Díaz, L. Kapitein, C. Moores, A. Akhmanova

Proceedings of the National Academy of Sciences. 2021, 118, None

https://doi.org/10.1529/biophysj.105.071209

]

проверена гипотеза о том, что дефекты решетки микротрубочки, связанные с переключением в ней количества протофиламентов, могут влиять на стабильность плюс-конца, приводя к его частым катастрофам. Для этого авторы полимеризовали микротрубочки в присутствии различных флуоресцентных веществ, которые, как известно по данным криоэлектронной микроскопии, способствуют образованию микротрубочек с различным числом протофиламентов. TIRF микроскопия позволила косвенным образом наблюдать наличие таких дефектов в теле микротрубочки в местах его взаимодействия с этими веществами.

Новые методы световой микроскопии микротрубочек

Как известно, один из основных недостатков флуоресцентной микроскопии связан с негативными эффектами самих флуоресцентных красителей, их фотообесцвечиванием и фототоксичными явлениями. Известно также, что флуоресцентно меченные микротрубочки при определённых условиях облучения способны разрушаться из-за образующихся свободных радикалов

[

Mechanism and Dynamics of Breakage of Fluorescent Microtubules

H. Guo, C. Xu, C. Liu, E. Qu, M. Yuan, Z. Li, B. Cheng, D. Zhang

Biophysical Journal. 2006, 90, 2093-2098

https://doi.org/10.1038/srep30393

]

. Поэтому сейчас возрастает интерес к развитиям нефлуоресцентных методов световой микроскопии. Кроме того, современные направления развития световой микроскопии в значительной степени представлены разработкой методов визуализации биологических образцов с субнанометровым разрешением. Воплощение обоих этих стремлений реализовано в методах ROCS (от англ. rotating coherent-scattering microscopy) и iSCAT (от англ. interferometric scattering microscopy).

ROCS микроскопия

Как известно, с одной стороны, косое освещение образца когерентным светом (например, лазером) позволяет добиться двукратного повышения разрешающей способности микроскопа по сравнению с нормальным падением света из-за более высоких порядков дифракции, собираемой объективом. С другой стороны, косое освещение когерентным светом приводит к слишком большому количеству артефактов интерференции и из-за этого, как считается, оно неприменимо в науках о жизни. Тем не менее, при вращении падающего лазерного луча на 360° во время одного цикла получения изображения удаётся реализовать некогерентное усреднение множества когерентных изображений, освещенных с разных направлений. Это, в свою очередь, позволяет разрешить структуры на расстоянии порядка четверти длины волны друг от друга, что недостижимо с помощью обычной (некогерентной) микроскопии. На этом принципе основана ROCS-микроскопия, которую авторы изобретения применили к исследованию микротрубочек

[

Fast, label-free super-resolution live-cell imaging using rotating coherent scattering (ROCS) microscopy

F. Jünger, P. Olshausen, A. Rohrbach

Scientific Reports. 2016, 6, None

https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.1c00271

]

. Им удалось совместить ROCS микроскопию в тёмнопольном режиме детектирования сигнала от образца с оптической ловушкой для того, чтобы обеспечить сильный контраст для структур, удаленных от покровного стекла — изолированных микротрубочек — и изучить их механические свойства

[

62,

Scattering-based Light Microscopy: From Metal Nanoparticles to Single Proteins

L. Priest, J. Peters, P. Kukura

Chemical Reviews. 2021, 121, 11937-11970

https://doi.org/10.1016/j.bpj.2017.10.036

Label-free Imaging and Bending Analysis of Microtubules by ROCS Microscopy and Optical Trapping

M. Koch, A. Rohrbach

Biophysical Journal. 2018, 114, 168-177

https://doi.org/10.1016/j.bpj.2017.10.036

]

По сравнению с тёмнопольной микроскопией, которая обеспечивает хороший контраст даже для слабо рассеивающих образцов, таких как актин или микротрубочки, а так же интерференционной микроскопией рассеянного света (iSCAT), о которой написано ниже, ROCS имеет ряд технических преимуществ. Так, реализация тёмнопольной микроскопии на основе коммерчески доступных компонентов, например, с помощью специальной конденсорной линзы, может быть несовместима с некоторыми конструкциями оптических ловушек. В то же время, альтернативные подходы с использованием метода тёмного поля до сих пор были способны отображать только сильно рассеивающие частицы золота размером 50 нм. В свою очередь, iSCAT уже был применён для достижения высокоскоростного отслеживания одиночных микротрубочек с высокой точностью, однако этот метод ограничен небольшим осевым расстоянием вблизи поверхности покровного стекла

[

Label-free Imaging and Bending Analysis of Microtubules by ROCS Microscopy and Optical Trapping

M. Koch, A. Rohrbach

Biophysical Journal. 2018, 114, 168-177

https://doi.org/10.1039/c2cp41013c

]

iSCAT микроскопия

В своей простейшей форме iSCAT можно рассматривать как эквивалент IRM с лазерным освещением. Лазерный луч плотно фокусируется на образце, и падающий свет, частично отраженный на границе раздела подложка-вода, собирается вместе со светом, рассеянным образцом. При этом в большинстве постановок лазерный луч сканирует образец для получения растрового изображения

[

Interferometric scattering microscopy (iSCAT): new frontiers in ultrafast and ultrasensitive optical microscopy

J. Ortega-Arroyo, P. Kukura

Physical Chemistry Chemical Physics. 2012, 14, 15625

https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.1c00271

]

. В отличие от IRM, iSCAT позволяет достичь большей чувствительности за счет использования источников когерентного света и оптимизированных методик обнаружения сигнала

[

62,

Scattering-based Light Microscopy: From Metal Nanoparticles to Single Proteins

L. Priest, J. Peters, P. Kukura

Chemical Reviews. 2021, 121, 11937-11970

https://doi.org/10.1021/nl500234t

Label-Free, All-Optical Detection, Imaging, and Tracking of a Single Protein

J. Ortega Arroyo, J. Andrecka, K. Spillane, N. Billington, Y. Takagi, J. Sellers, P. Kukura

Nano Letters. 2014, 14, 2065-2070

https://doi.org/10.1016/j.bpj.2015.10.055

]

Применение iSCAT микроскопии для отслеживания микротрубочек без использования флуоресцентных меток с высокой точностью (нм) и частотой кадров (килогерц) было продемонстрировано в работе

[

Label-free Imaging of Microtubules with Sub-nm Precision Using Interferometric Scattering Microscopy

J. Andrecka, J. Ortega Arroyo, K. Lewis, R. Cross, P. Kukura

Biophysical Journal. 2016, 110, 214-217

https://doi.org/10.7554/eLife.51992

]

. Затем начали появляться работы, в которых этот метод использовался в различных целях. В работе

[

The speed of GTP hydrolysis determines GTP cap size and controls microtubule stability

J. Roostalu, C. Thomas, N. Cade, S. Kunzelmann, I. Taylor, T. Surrey

eLife. 2020, 9, None

https://doi.org/10.1073/pnas.1815823116

]

изучалась динамика микротрубочек, полимеризующихся из рекомбинантного тубулина, не обладающего способностью гидролизовать ГТФ. Подробная характеристика свойств этого тубулина с помощью iSCAT позволила установить критически важную роль кинетики гидролиза ГТФ не только в динамическом поведении микротрубочкек, но и на стадии их нуклеации.

Впечатляющие эксперименты на основе iSCAT реализованы в работах

[

68,

Direct observation of individual tubulin dimers binding to growing microtubules

K. Mickolajczyk, E. Geyer, T. Kim, L. Rice, W. Hancock

Proceedings of the National Academy of Sciences. 2019, 116, 7314-7322

https://doi.org/10.1002/smtd.202000985

Nanoscopic Structural Fluctuations of Disassembling Microtubules Revealed by Label‐Free Super‐Resolution Microscopy

M. Vala, Ł. Bujak, A. García Marín, K. Holanová, V. Henrichs, M. Braun, Z. Lánský, M. Piliarik

Small Methods. 2021, 5, 2000985

https://doi.org/10.1086/BBLv189n2p206

]

для изучения структуры растущих концов микротрубочек. В первом случае iSCAT позволил напрямую наблюдать встраивание димеров тубулина в тело микротрубочки с помощью золотых наночастиц размером 20 нм, ковалентно прикреплённых к молекулам рекомбинантного тубулина. Во второй работе визуализировались временны́е структурные изменения протофиламентов на кончике разбирающейся микротрубочки. Авторы этой работы утверждают, что с помощью реализованного ими метода на основе iSCAT микроскопии удалось детектировать переход упорядоченных протофиламентов в неупорядоченную конформацию на кончике микротрубочки при её индуцированной разборке.

Атомно-силовая микроскопия микротрубочек

Внутри клетки контроль динамической нестабильности микротрубочек соответствующими ферментами, например, ассоциированными с ними деполимеразами, необходим для организации сложных комплексов из нескольких микротрубочек, таких как веретено деления или аксонемы. Обладая очевидными достоинствами, методы световой микроскопии, тем не менее, плохо применимы для изучения процессов, затрагивающих внутреннюю организацию микротрубочек, тем более, если микротрубочки не изолированы, а, как в клетке, собраны в пучки. Существующим методам оптической и электронной микроскопии не хватает пространственно-временного разрешения для наблюдения динамики отдельных микротрубочек внутри подобных пучков. Хотя, например, оптическая микроскопия и позволяет определить количество микротрубочек в составе такого пучка, она, тем не менее, не способна разрешить их пространственно

[

Quantifying Single and Bundled Microtubules with the Polarized Light Microscope

P. Tran, E. Salmon, R. Oldenbourg

The Biological Bulletin. 1995, 189, 206-206

]

. Применительно к этой задаче, как показано в работе

[

Atomic force microscopy reveals distinct protofilament-scale structural dynamics in depolymerizing microtubule arrays

S. Wijeratne, M. Marchan, J. Tresback, R. Subramanian

Proceedings of the National Academy of Sciences. 2022, 119, None

https://doi.org/10.1103/PhysRevLett.56.930

]

. АСМ можно считать тем инструментом, который позволяет заменить световую микроскопию в данном случае для успешного сопоставления процессов в нано- и микромасштабах.

Поэтому одним из немногих методов прямого наблюдения нанометровой структуры микротрубочек в естественных условиях, то есть в растворе буфера и при физиологических температурах, является атомно-силовая микроскопия (Рис. 6 А), которая активно развивается в настоящее время после изобретения в 1986 году

[

Atomic Force Microscope

G. Binnig, C. Quate, C. Gerber

Physical Review Letters. 1986, 56, 930-933

https://doi.org/10.1038/nnano.2017.45

]

. В основе АСМ лежит простой принцип сканирования образца с помощью крошечного зонда, кантилевера, которое можно производить почти в любых условиях (в воздухе, в жидкости, при различных температурах и тд.), в том числе, тех, которые наиболее соответствуют естественным для биологического образца (то есть физиологическим). Основные стадии развития этого метода связаны с изобретением новых мод сканирования, среди которых основными являются контактная и динамическая (Рис. 6 Б, В)

[

Imaging modes of atomic force microscopy for application in molecular and cell biology

Y. Dufrêne, T. Ando, R. Garcia, D. Alsteens, D. Martinez-Martin, A. Engel, C. Gerber, D. Müller

Nature Nanotechnology. 2017, 12, 295-307

https://doi.org/10.1002/sca.20173

]

Принцип работы атомно-силового микроскопа. A) С помощью зонда (кантилевера), приводящегося в движением пьезоэлементом (или, наоборот, за счёт движение самого образца), происходит ощупывание образца. Сигнал взаимодействия кантилевера с образцом детектируется по отклонению лазерного луча. Б), В) Две основные моды работы АСМ – контактная (Б) и динамическая (В) – позволяют проводить измерения жесткости микротрубочек и визуализировать динамику их тела.

Figure 6. Принцип работы атомно-силового микроскопа. A) С помощью зонда (кантилевера), приводящегося в движением пьезоэлементом (или, наоборот, за счёт движение самого образца), происходит ощупывание образца. Сигнал взаимодействия кантилевера с образцом детектируется по отклонению лазерного луча. Б), В) Две основные моды работы АСМ – контактная (Б) и динамическая (В) – позволяют проводить измерения жесткости микротрубочек и визуализировать динамику их тела.

Контактная мода (Рис. 6 Б) основана на поддержании постоянного отклонения кантилевера (и, следовательно, силы его взаимодействия с образцом) за счёт регулирования расстояния между ним и образцом с помощью системы обратной связи. Постоянный контакт между кантилевером и образцом позволяет получать топографическую картину с высоким пространственным разрешением. Однако нежелательным эффектом такого сканирования может быть нарушение структуры самого образца, и, в особенности, мягких биологических препаратов. Динамический (бесконтактный или полуконтактный) режим (Рис. 6 В) реализуется, когда кантилевер колеблется на резонансной (или близкой к ней) частоте. В зависимости от расстояния от образца частота колебания кантилевера меняется, что также позволяет измерять топографию, осуществляя амплитудную или частотную модуляцию с помощью системы обратной связи. Основное преимущество динамической моды по сравнению с контактной заключается в отсутствии непосредственного контакта с образцом. Относительно слабое взаимодействия с кантилевером не приводит к деформациям образца, почти не влияет на характеристики его поверхности и, следовательно, больше подходит для изучения биологических объектов. АСМ позволяет не только получать изображение рельефа образца с большим пространственным разрешением, но и измерять зависимость силы взаимодействия между кантилевером и образцом от расстояния между ними. Так называемая силовая кривая может дать ценную информацию о местных свойствах материала образца (эластичность, твердость, адгезия, плотность поверхностного заряда и тд.)

[

73,

Application of AFM in microbiology: a review

S. Liu, Y. Wang

Scanning. 2010, 32, 61-73

https://doi.org/10.1016/j.surfrep.2005.08.003

Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications

H. Butt, B. Cappella, M. Kappl

Surface Science Reports. 2005, 59, 1-152

https://doi.org/10.1038/s41565-018-0149-4

]

. Кроме того, режим построения силовой кривой может быть также использован для исследования топографии образца, и в ряде случаев имеет преимущества по сравнению с остальными модами, например, при реализации высокоскоростного сканирования

[

High-speed photothermal off-resonance atomic force microscopy reveals assembly routes of centriolar scaffold protein SAS-6

A. Nievergelt, N. Banterle, S. Andany, P. Gönczy, G. Fantner

Nature Nanotechnology. 2018, 13, 696-701

https://doi.org/10.1007/s00424-008-0448-y

]

Таким образом, основные возможности АСМ позволяют получать изображения образца с субнанометровым разрешением, контролируемо прикладывать к нему силы посредствам кантилевера, измерять их, наблюдать за процессом деформации образца в результате такого воздействия и осуществлять наноманипуляции с ним. Выполнение этих действий производится одним кантилевером, поэтому для их последовательной реализации необходимо использование различных мод. На этой основе, например, техника наноиндентаций позволяет изучать упругие свойства микротрубочек

[

76,

Probing nanomechanical properties from biomolecules to living cells

S. Kasas, G. Dietler

Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 2008, 456, 13-27

https://doi.org/10.1016/0304-3991(94)00194-R

77,

Immobilizing and imaging microtubules by atomic force microscopy

A. Vinckier, I. Heyvaert, A. D'Hoore, T. McKittrick, C. Van Haesendonck, Y. Engelborghs, L. Hellemans

Ultramicroscopy. 1995, 57, 337-343

https://doi.org/10.1103/PhysRevLett.89.248101

78,

Nanomechanics of Microtubules

A. Kis, S. Kasas, B. Babić, A. Kulik, W. Benoît, G. Briggs, C. Schönenberger, S. Catsicas, L. Forró

Physical Review Letters. 2002, 89, None

https://doi.org/10.1103/PhysRevLett.91.098101

79,

Deformation and Collapse of Microtubules on the Nanometer Scale

P. de Pablo, I. Schaap, F. MacKintosh, C. Schmidt

Physical Review Letters. 2003, 91, None

https://doi.org/10.1529/biophysj.105.077826

80,

Elastic Response, Buckling, and Instability of Microtubules under Radial Indentation

I. Schaap, C. Carrasco, P. de Pablo, F. MacKintosh, C. Schmidt

Biophysical Journal. 2006, 91, 1521-1531

https://doi.org/10.1021/jp0716637

Enhanced Mechanical Stability of Microtubules Polymerized with a Slowly Hydrolyzable Nucleotide Analogue

K. Munson, P. Mulugeta, Z. Donhauser

The Journal of Physical Chemistry B. 2007, 111, 5053-5057

https://doi.org/10.1021/jp0716637

]

. Результаты измерений, проведённые в работе

[

Enhanced Mechanical Stability of Microtubules Polymerized with a Slowly Hydrolyzable Nucleotide Analogue

K. Munson, P. Mulugeta, Z. Donhauser

The Journal of Physical Chemistry B. 2007, 111, 5053-5057

https://doi.org/10.1063/5.0032948

]

, демонстрируют большее значение жесткости для микротрубочек, полимеризующихся в присутствии GMPCPP вместо ГТФ и таксола, что согласуется с данными, полученными с помощью оптической микроскопии и лазерной ловушки (выше).

Одно из основных направлений развития АСМ в настоящее время связано с реализацией методики быстрого АСМ, позволяющего наблюдать за молекулярными процессами в реальном времени. Сейчас, в зависимости от многих факторов, удаётся достичь скоростей сканирования образца порядка 1–12.5 кадров/секунду и пространственное разрешение 1–50 нм (а при некоторых условиях, например, при наблюдении мембранных белков, меньше 1 нм)

[

Faster high-speed atomic force microscopy for imaging of biomolecular processes

S. Fukuda, T. Ando

Review of Scientific Instruments. 2021, 92, 033705

https://doi.org//10.1039/c8nr07392a

]

. На основе методики быстрого АСМ, разработанного в группе Андо, в работе

[

Microtubule self-healing and defect creation investigated by in-line force measurements during high-speed atomic force microscopy imaging

C. Ganser, T. Uchihashi

Nanoscale. 2019, 11, 125-135

https://doi.org/10.1529/biophysj.105.077826

]

производилась визуализация дефектов в теле микротрубочки. В отличие от работы

[

Elastic Response, Buckling, and Instability of Microtubules under Radial Indentation

I. Schaap, C. Carrasco, P. de Pablo, F. MacKintosh, C. Schmidt

Biophysical Journal. 2006, 91, 1521-1531

]

, в данном случае с помощью быстрого АСМ удалось наблюдать процесс самовосстановления решетки микротрубочки после воздействия на неё кантилевером с временным разрешением 500 мс.

Возможность наблюдение динамики тела микротрубочек на уровне отдельных протофиламентов с помощью АСМ впервые продемонстрирована в работах

[

70,

Atomic force microscopy reveals distinct protofilament-scale structural dynamics in depolymerizing microtubule arrays

S. Wijeratne, M. Marchan, J. Tresback, R. Subramanian

Proceedings of the National Academy of Sciences. 2022, 119, None

https://doi.org/10.1063/5.0032948

Faster high-speed atomic force microscopy for imaging of biomolecular processes

S. Fukuda, T. Ando

Review of Scientific Instruments. 2021, 92, 033705

]

. В работе

[

Atomic force microscopy reveals distinct protofilament-scale structural dynamics in depolymerizing microtubule arrays

S. Wijeratne, M. Marchan, J. Tresback, R. Subramanian

Proceedings of the National Academy of Sciences. 2022, 119, None

]

изучались молекулярные механизмы ремоделирования пучков из микротрубочек с помощью двух разных деполимераз: кинезина-8 Kip3p, и кинезина-13 MCAK. АСМ позволил установить, что, в отличие от Kip3p, MCAK вызывает разрушение тела микротрубочки в виде разрастающегося дефекта за счет асинхронной деполимеризации протофиламентов.

Некоторые из нерешённых задач

Перечисленные экспериментальные методы изучения динамики микротрубочек в условиях in vitro эксперимента уже позволили ответить на широкий круг вопросов, охватывающих как саму природу динамической нестабильности микротрубочек, так и способов её регуляции. В настоящее время происходит углублённое исследование параметров динамической нестабильности микротрубочек. Основные не решённые до конца вопросы связаны тем, как структура концов и тела микротрубочки, наличие в её регулярной решётке различного рода дефектов, взаимодействие с регуляторными молекулами, может влиять на поведение всей микротрубочки.

Например, до сих пор нет единого мнения относительно того, существуют ли спасения микротрубочек in vitro или нет. С момента появления первых работ по измерению параметров динамической нестабильности до настоящего времени выходят работы, в которых спасения как наблюдаются

[

12,

Visualization of the dynamic instability of individual microtubules by dark-field microscopy

T. Horio, H. Hotani

Nature. 1986, 321, 605-607

https://doi.org/10.1083/jcb.107.4.1437

26,

Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies.

R. Walker, E. O'Brien, N. Pryer, M. Soboeiro, W. Voter, H. Erickson, E. Salmon

Journal of Cell Biology. 1988, 107, 1437-1448

https://doi.org/10.1142/9789812790866_0048

27,

Asymmetric behavior of severed microtubule ends after ultraviolet-microbeam irradiation of individual microtubules in vitro

Walker RA, Inoué S, Salmon ED.

Collected Works of Shinya Inoué. 2008, 108, 649-56

https://doi.org/10.1021/bi00480a014

29,

Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules

E. O'Brien, E. Salmon, R. Walker, H. Erickson

Biochemistry. 1990, 29, 6648-6656

https://doi.org/10.1083/jcb.127.4.985

32,

XMAP from Xenopus eggs promotes rapid plus end assembly of microtubules and rapid microtubule polymer turnover.

R. Vasquez, D. Gard, L. Cassimeris

Journal of Cell Biology. 1994, 127, 985-993

https://doi.org/10.1103/PhysRevE.50.1579

84,

Phase diagram of microtubules

D. Fygenson, E. Braun, A. Libchaber

Physical Review E. 1994, 50, 1579-1588

https://doi.org/10.1021/bi9616965

85,

Dynamic Instability of Microtubules Assembled from Microtubule-Associated Protein-Free Tubulin: Neither Variability of Growth and Shortening Rates nor “Rescue” Requires Microtubule-Associated Proteins

M. Billger, G. Bhatacharjee, R. Williams

Biochemistry. 1996, 35, 13656-13663

https://doi.org/10.1083/jcb.138.1.105

15,

A Metastable Intermediate State of Microtubule Dynamic Instability That Differs Significantly between Plus and Minus Ends

P. Tran, R. Walker, E. Salmon

Journal of Cell Biology. 1997, 138, 105-117

https://doi.org/10.1038/ncb1703

86,

EB1 regulates microtubule dynamics and tubulin sheet closure in vitro

B. Vitre, F. Coquelle, C. Heichette, C. Garnier, D. Chrétien, I. Arnal

Nature Cell Biology. 2008, 10, 415-421

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0030103

87,

Islands Containing Slowly Hydrolyzable GTP Analogs Promote Microtubule Rescues

C. Tropini, E. Roth, M. Zanic, M. Gardner, J. Howard

PLoS ONE. 2012, 7, e30103

https://doi.org/10.1091/mbc.E18-08-0541

A unified model for microtubule rescue

C. Fees, J. Moore

Molecular Biology of the Cell. 2019, 30, 753-765

https://doi.org/10.1247/csf.19.279

]

, так и не наблюдаются

[

19,

Microtubule-Stabilizing Activity of Microtubule-Associated Proteins (MAPs) Is Due to Increase in Frequency of Rescue in Dynamic Instability: Shortening Length Decreases with Binding of MAPs onto Microtubules.

T. Itoh, H. Hotani

Cell Structure and Function. 1994, 19, 279-290

https://doi.org/10.1083/jcb.129.5.1311

89,

Structure of growing microtubule ends: two-dimensional sheets close into tubes at variable rates.

D. Chrétien, S. Fuller, E. Karsenti

Journal of Cell Biology. 1995, 129, 1311-1328

https://doi.org/10.1006/jsbi.1997.3844

90,

How Tubulin Subunits Are Lost from the Shortening Ends of Microtubules

P. Tran, P. Joshi, E. Salmon

Journal of Structural Biology. 1997, 118, 107-118

https://doi.org/10.1002/(SICI)1097-0169(1997)38:3<278::AID-CM6>3.0.CO;2-1

28,

In vitro assembled plant microtubules exhibit a high state of dynamic instability

R. Moore, M. Zhang, L. Cassimeris, R. Cyr

Cell Motility and the Cytoskeleton. 1997, 38, 278-286

https://doi.org/10.1126/science.1064629

34,

Reconstitution of Physiological Microtubule Dynamics Using Purified Components

K. Kinoshita, I. Arnal, A. Desai, D. Drechsel, A. Hyman

Science. 2001, 294, 1340-1343

https://doi.org/10.1016/j.devcel.2010.07.016

91,

CLASP Promotes Microtubule Rescue by Recruiting Tubulin Dimers to the Microtubule

J. Al-Bassam, H. Kim, G. Brouhard, A. van Oijen, S. Harrison, F. Chang

Developmental Cell. 2010, 19, 245-258

https://doi.org/10.1016/j.cell.2011.10.037

58,

Depolymerizing Kinesins Kip3 and MCAK Shape Cellular Microtubule Architecture by Differential Control of Catastrophe

M. Gardner, M. Zanic, C. Gell, V. Bormuth, J. Howard

Cell. 2011, 147, 1092-1103

https://doi.org/10.1074/jbc.M114.584300

33,

Stu2, the Budding Yeast XMAP215/Dis1 Homolog, Promotes Assembly of Yeast Microtubules by Increasing Growth Rate and Decreasing Catastrophe Frequency

M. Podolski, M. Mahamdeh, J. Howard

Journal of Biological Chemistry. 2014, 289, 28087-28093

https://doi.org/10.1073/pnas.1818824116

Spastin is a dual-function enzyme that severs microtubules and promotes their regrowth to increase the number and mass of microtubules

Y. Kuo, O. Trottier, M. Mahamdeh, J. Howard

Proceedings of the National Academy of Sciences. 2019, 116, 5533-5541

https://doi.org/10.1007/s00249-021-01558-w

]

. С чем связана такая несогласованность экспериментальных данных пока остаётся неясным. Тем не менее, считается, что наличие ГТФ-тубулина в теле микротрубочки (в виде так называемых ГТФ-островков), например, за счёт его встраивания в местах дефектов микротрубочки, может быть основным механизмом спасений. Там, где спасения наблюдаются, их частота значительно меньше частоты катастроф, то есть эти события являются относительно редкими. Поэтому, чтобы правильно охарактеризовать частоту спасений, необходимо, в первую очередь, набирать большую статистику периодов полимеризации и деполимеризации микротрубочек. Кроме этого, необходимы чёткие критерии того, какие события можно считать спасениями и катастрофами. Все эти особенности необходимо учитывать для правильного дизайна эксперимента, куда входит, в том числе, выбор метода микроскопии и метода обработки полученных данных. Набор большой статистики возможен как за счет увеличения времени съёмки микротрубочек, так и за счет выбора большего количества микротрубочек, однако в первом случае необходимо учитывать фоторазрушающие эффекты, появляющиеся, в том числе, при длительной экспозиции. Это, в свою очередь, диктует необходимость соблюдать тонкий баланс между временем съёмки и частотой кадров в единицу времени для того, чтобы, с одной стороны, избежать фоторазрушения микротрубочки, и, с другой стороны, чтобы не пропустить редкие события спасений. Вместе с этим, как показано нами in vitro (

[

13(th) EBSA congress, July 24-28, 2021, Vienna, Austria

None

European Biophysics Journal. 2021, 50, 1-226

https://doi.org/10.1091/mbc.E20-06-0348

]

), возможен учёт близости покровного стекла к микротрубочке и его непосредственной роли в появлении дефектов в теле микротрубочки, образовании ГТФ-островков и возникновении спасений. Кроме того, параметры динамической нестабильности плюс- и минус-концов микротрубочек, в том числе, их частоты спасений, отличаются из-за каких-то не известных до сих пор механизмов.

В работах

[

93,

Quantification of microtubule stutters: dynamic instability behaviors that are strongly associated with catastrophe

S. Mahserejian, J. Scripture, A. Mauro, E. Lawrence, E. Jonasson, K. Murray, J. Li, M. Gardner, M. Alber, M. Zanic, H. Goodson

Molecular Biology of the Cell. 2022, 33, None

https://doi.org/10.1007/s12195-010-0155-6

Microtubule Tip Tracking and Tip Structures at the Nanometer Scale Using Digital Fluorescence Microscopy

A. Demchouk, M. Gardner, D. Odde

Cellular and Molecular Bioengineering. 2011, 4, 192-204

]

подчёркнута важность применения автоматизированных методов отслеживания динамических концов микротрубочек для того, чтобы можно было осуществить максимально подробный и беспристрастный анализ параметров динамической нестабильности микротрубочек. В свою очередь, применение современных нефлуоресцентных методов световой микроскопии (IRM, iSCAT) уже показало свою эффективность и приоритет по сравнению с флуоресцентной микроскопией на этом поприще.

Другие многочисленные нерешённые задачи связаны с регуляцией динамики микротрубочек с помощью специальных молекул. В этой связи TIRF микроскопия во многом незаменима, потому что позволяет напрямую детектировать взаимодействие микротрубочек с регуляторными молекулами (ассоциированными с микротрубочками флуоресцентно меченными белками или ингибиторами тубулина).

Применение атомно-силовой микроскопии для изучения микротрубочек открывает большие возможности для изучения их механических свойств, молекулярных механизмов динамической нестабильности и её регуляции. Очень перспективным выглядит использование АСМ для изучения многих вопросов, подобно работе

[

Atomic force microscopy reveals distinct protofilament-scale structural dynamics in depolymerizing microtubule arrays

S. Wijeratne, M. Marchan, J. Tresback, R. Subramanian

Proceedings of the National Academy of Sciences. 2022, 119, None