Введение

Плазматическая мембрана – сложная структура, состоящая из белков и липидов и поддерживаемая клеточным цитоскелетом [1]. Вязкость и текучесть мембраны обеспечиваются её липидным составом, различающимся как у разных клеток, так и у одной клетки в разные моменты времени [2]. Гибкость мембраны и возможность диффузии её составляющих поддерживается подмембранным цитоскелетом – актиновым кортексом [3,4]. Задачей настоящего обзора является систематизация информации о трёх явлениях нарушения целостности мембраны, происходящих при участии кортексного цитоскелета. Спектр биологических функций этих явлений включает поддержание структуры, миграцию и коммуникацию [5]. Каждое из этих явлений по-отдельности описано в других обзорах [6–8], однако, в настоящем обзоре мы фокусируемся на параллелях в этих явлениях.

Далее мы кратко опишем эти процессы. Репарация или починка мембраны (plasma membrane repair, рис. 1А) – это процесс восстановления целостности плазматической мембраны клетки после образования повреждения в результате механического или химического воздействия [9]. Явление репарации мембраны наблюдается в клетках всех эукариот с характерными временами рознящимися от нескольких секунд до минут [10]. Существует несколько теоретических моделей процесса репарации мембраны. В соответствии с одной из этих моделей, после повреждения по периферии образовавшейся бреши образуется сократительное актомиозиновое кольцо, сходное с сократительным кольцом, разделяющим мембраны дочерних клеток при цитокинезе. Это кольцо далее стягивается, подтягивая края бреши друг к другу, так, что они в конце могут вновь слиться. Эта модель репарации рассматривается здесь в первую очередь, поскольку она ближе всего к двум другим рассматриваемым процессам. К другим моделям репарации относится стягивание краёв бреши при помощи белков ESCRT, закрытие бреши внутриклеточными везикулами и другие [11]. Репарация мембран имеет первостепенное значение для мышечной ткани, поскольку её клетки наиболее подвержены повреждениям [9], при этом сигналом запуска репарации является локальное повышение концентрации ионов кальция, вызванное его диффузией через повреждение [12].

Блеббинг (Рис. 2) – это процесс, при котором на поверхности клетки образуются протрузии, характеризующихся округлой формой, характерными размерами до нескольких микрометров [13,14] и типичным жизненным циклом, состоящим из стадий быстрого увеличения, короткой статической фазы и постепенного сжатия до исходного состояния мембраны [15]. Блеббинг используется некоторыми клетками в особом механизме миграции (амебоидная миграция).

Внеклеточные везикулы представляют собой любые внеклеточные структуры, окружённые липидным бислоем [16]. Среди внеклеточных везикул выделяют экзосомы, микровезикулы и апоптотические тела. Микровезикулы характеризуются образованием непосредственно из плазматической мембраны клетки (Рис. 1В) и размерами 150-1000 нм [16]. Экзосомы образуются из эндосом при их слиянии с клеточной мембраной и имеют меньшие размеры. Апоптотические тела представляют собой оставшиеся после клеточной смерти клеточные фрагменты. Здесь рассматривается только микровезикуляция как процесс образования микровезикул. Количество циркулирующих везикул, в том числе микровезикул, повышается во многих патологических состояниях, но они также участвуют и во многих физиологических процессах, таких как регенерация тканей и иммунный ответ [6]. Везикулы одного организма могут передавать своё содержимое (в том числе функционально активные РНК) в клетки другого, в том числе другого вида [17].

 

Figure 1. Схема процессов репарации мембраны (А), блеббинга (Б) и микровезикуляции (В). Повреждение клеточной мембраны или активация клетки вызывает подъём кальция посредством его входа через разрыв мембраны или выхода из эндоплазматического ретикулума через каналы SERCA. Кальций вызывает цепь сигнальных событий, приводящую к активации GTPазы RhoA, которая активирует киназу ROCK, активирующую киназу LIMK, которая в свою очередь активирует миозин-II и кофилин, запуская формирование сократительных волокон. Под действием кальциевой сигнализации к месту повреждения также привлекаются белки ESCRT (см. текст). При активации клетки из-за усиленного актомиозинового сокращения поднимается внутриклеточное давление, что может запустить блеббинг или везикуляцию, вызвав отрыв мембраны от актинового кортекса. В нормальном состоянии мембрана фиксирована на актиновом кортексе при помощи белков ERM (ezrin, radixin, moesin).

 

Начальная деформация мембраны

В работе [13] было сделано наблюдение, что в месте повреждения возникает «выпячивание» мембраны размером порядка нескольких микрометров (Рис. 6G и graphical abstract). Авторы [13] высказали гипотезу, что это связано с локальным уменьшением натяжения мембраны, вызванного привлечением дополнительных мембран при сопутствующем экзоцитозе и деградацией актина [19]. Уменьшение целостности актинового кортекса и/или локальное увеличение внутриклеточного давления, вызванное различной осмолярностью с разных сторон мембраны [20], также способствует блеббингу.

Figure 2. Конфокальные микрофотографии индуцированного тромбином блеббинга мембраны клеток HEK-293. Воспроизведено из работы [14], лицензия ССС 1300113-1. Клетки инкубированы с DMSO (A) или блеббистатином (ингибитор миозина II, среди прочих процессов ингибирует блеббинг, 10 µM) (Б) 15 мин, после этого производилось 2-минутная активация тромбином (3 U/ml). Стрелками указаны места блеббинга. Размеры отрезков - 20 мкм.

И везикуляция, и блеббинг зависят от липидного состава мембраны [16]. Можно предположить, что эта зависимость связана как с ролью гидростатического давления, эффекты которого зависят от вязкости мембраны и от различных белками, изгибающих мембрану. Так, изменение активности фосфолипаз, происходящее при активации клетки, ведет к изменению состава мембраны [23], а связывающиеся с отрицательно заряженными фосфолипидами аннексины изменяют кривизну мембраны, способствуя блеббингу и везикуляции [24].

С другой стороны, в мембране также присутствуют липидные рафты, роль которых в процессах деформации мембраны неоднозначна. Известно, что снижение содержания холестерина в мембранах ингибирует везикуляцию [25], а в работе [26] показано, что циркулирующие в крови моноцитарные и макрофаговые везикулы происходят из липидных рафтов. В микровезикулах также повышено содержание лизофосфатидилхолинов, сфингомиелинов и ацилкарнитинов [27]. Церамид также влияет на образование микровезикул [28]. Известно, что ингибирование сфингомиелиназ ведёт одновременно к уменьшению количества экзосом и к увеличению количества и размера микровезикул, а также к изменению их загрузки [29]. Таким образом, липидный состав мембраны однозначно влияет на процесс везикуляции и блеббинга, однако, механизмы этого влияния до конца не изучены.

Увеличение размеров деформации мембраны

Figure 3. Участие малых GTP-аз в репарации мембраны. Воспроизведено из [37]. XY-проекция конфокального изображения лазерного повреждения мембраны клеток плодовой мушки, экспрессирующих флуоресцентно меченные белки. В верхней линии показаны распределение Rho1 (красный) и актина (зеленый), на средней линии показаны распределение Cdc42 (красный) и актина (зеленый); на нижней линии показаны распределение актина (красный) и Rac1 (зеленый). Размер отрезка 20 µm. «merge» – объединение монохромных изображений.

 

Наблюдаемые переходы между репарацией мембраны, везикуляцией и блеббингом 

Если рассматривать блеббинг как необходимую часть амебоидного движения клеток, то тот факт, что микровезикуляция и миграция вызывается одним и тем же стимулом, также свидетельствует о сходстве данных процессов [45].

Заключение

Так, все три процесса запускаются случайным локальным разрушением клеточной мембраны, её адгезии к актиновому кортексу или самого актинового кортекса. Это случайное разрушение может происходить под действием внешнего воздействия на клетку или внутреннего спонтанного уменьшения прочности. Перестройка примембранного актинового цитоскелета начинается после начального возмущения, и заключается в восстановлении целостности цитоскелета. С другой стороны, при активации клетки, в результате увеличения напряжения во всех актомиозиновых фибриллах клетки, увеличивается внутриклеточное давление, что само может вызвать локальное отделение мембраны от актинового кортекса. Таким образом, перестройка цитоскелета в этих процессах играет двоякую роль: с одной стороны, она косвенно может приводить к запуску блеббинга и везикуляции, а с другой, сами эти процессы вызывают локальную перестройку, направленную на восстановление целостности клеточной оболочки.

Далее, все три процесса являются кальцийзависимыми (хотя характерные концентрации кальция для них различаются и механизмы передачи кальциевого сигнала могут быть различны) и все три управляются сигнализацией малых GTPаз семейства Rho. Наконец, все три процесса представляют собой ответ на  некоторое возмущение нормального состояния клетки или играют роль в патологических состояниях. Так, репарация мембраны является вынужденным ответом на повреждения мембраны и при его отсутствии не активна. Блеббинг по сути является восстановлением повреждения кортекса или его связи с мембраной и тоже может быть отнесён к репарационным процессам. Можно предположить, что, в результате приобретения новой независимой функции в процессе эволюции, он имеет и другие роли, такие как обеспечение симметричного цитокинеза и амебоидная миграция. Внеклеточные везикулы, в свою очередь, принимают участие в развитии множества патологических состояний, таких как аутоиммунные заболевания и рак.

Вклад авторов

Конфликт интересов

Финансирование