Русский 
English Преимущество применения лактадгерина для оценки экспонирования фосфатидилсерина в тромбоцитах
Введение
Тромбоциты – безъядерные клетки, циркулирующие в крови в неактивном состоянии. Их главная функция – формирование тромбов в месте повреждения сосудов. При стимуляции тромбоциты переходят в активированное состояние и разделяются на две субпопуляции, отличающиеся по морфологии, белковым покровам и функциям(1, 2):
1) проагрегатные тромбоциты – клетки с активированными интегринами aIIbb3, за счет которых тромбоциты способны агрегировать друг с другом. Охарактеризованы физиологически низким уровнем внутриклеточного кальция, не обладают свойством ускорять процессы свёртывания (прокоагулянтной активностью);
2) прокоагулянтные тромбоциты – обладают покровом из альфа-гранулярных белков, таких как фактор XIIIa, фактор V, фибриноген, тканевая трансглутаминаза (3, 4) и др. и имеют свойство ускорять реакции свертывания крови посредством экспонированных наружу отрицательно заряженных фосфолипидов(5). По современным представлением эта субпопуляция состоит из погибших клеток, у них деградирован цитоскелет, нарушена целостность мембраны, митохондрии не функционируют, концентрация внутриклеточного кальция высокая (6).
Соотношение субпопуляций тромбоцитов при активации зависит от концентрации активаторов и исходного состояния тромбоцитов. Ранее было показано, что клетки с большим начальным уровнем кальция и меньшим числом митохондрий имеют повышенную склонность к переходу в прокоагулянтное состояние (6, 7).
Сердечно-сосудистые заболевания являются самой распространенной причиной смертности в мире. Роль прокоагулянтной субпопуляции тромбоцитов в процессе тромбообразования и развитии различных патологических ситуаций до сих пор точно не определена, хотя и существуют различные гипотезы (8). В последнее десятилетие Prodan C. и Dale G. активно ведут исследования связей прокоагулянтной субпопуляции с сердечно-сосудистыми заболеваниями и их последствиями. Таким образом, понимание механизмов формирования субпопуляций является важной физиологической задачей.
Одним из удобных и широко применяемых способов определения погибших клеток являются маркеры на фосфатидилсерин, такие как аннексин V, плацентарный антикоагулянтный протеин PAP-1, и лактадгерин, гликопротеин, содержащийся в молоке, имеющий домен, подобный эпидермальному фактору роста 8, и так же известный как MFG-E8. Они детектируют фосфатидилсерин, расположенный на внешней мембране клетки и имеют близкие константы диссоциации(9-11). Фосфатидилсерин является основным отрицательно-заряженным фосфолипидом, входящим в состав клеточных мембран, и его содержание в мембране достигает 10%. В живой клетке такие фосфолипиды находятся на цитоплазматической поверхности мембраны (повернутой внутрь клетки), и в случае гибели клетки, за счет остановки работы флоппаз/флиппаз и активации кальций-зависимых скрамблаз, распределение фосфолипидов на мембране выравнивается. Аннексин V начали применять раньше, чем лактадгерин, и за счет этого он использовался в большинстве работ по изучению сигнальных процессов, происходящих при разделении тромбоцитов на субпопуляции как при помощи цитометрии, так и микроскопии. С появлением лактадгерина, было показано, что он обладает большей чувствительностью, чем аннексин V(12), в данной работе было исследовано это преимущество при помощи микроскопии.
Материалы и методы
Тромбоциты были выделены из цельной крови здоровых доноров при помощи центрифугирования, затем осаждались 20 минут на подготовленные покровные стекла с нанесенным на них фибриногеном в отсутствии/присутствии 200 нМ тетраметилродамина для определения потенциала митохондриальной мембраны, далее отмывались от краски, и после инкубировались с флуоресцентно-меченным лактадгерином-ФИТЦ (Haematologic Technologies Prolytix) и/или аннексином V-Алекса 647 (аннексин v синтезирован в лаборатории ЦТП ФХФ РАН и помечен флуоресцентной краской Алекса 647, Molecular Probes) в течение 30 минут. В конце проводилась съемка флуоресцентных зондов при помощи конфокального микроскопа Zeiss Axio Observer Z1 с диском Нипкова. Подробно методы описаны в статье (7).
Результаты и обсуждение
В результате экспериментов с совместным применением лактадгерина и аннексина V было установлено, что тромбоциты после инкубации на подложке могут быть положительными или отрицательными по обоим маркерам, или положительными по лактадгерину и отрицательными по аннексину V, но не наоборот (рис. 1А). Во-первых, это подтверждает более высокую чувствительность лактадгерина, что согласуется с ранее опубликованными цитометрическими работами, использовавшими лактадгерин для оценки фосфатидилсерин положительных тромбоцитов(12) и эритроцитов(13). Вероятно, большая чувствительность лактадгерина связана с пороговой чувствительностью аннексина V, для связывания которого необходимо более 2% фосфатидилсерина на мембране(14). Во-вторых, особый интерес представляет состояние тромбоцита, показанное при помощи эксперимента с оценкой работоспособности митохондрий на рисунке 1Б - с наличием митохондриального потенциала и положительной окраской по лактадгерину. Ранее мы проводили исследования по параллельному измерению внутриклеточного кальция, изменению потенциала митохондриальной мембраны и выхода фосфатидилсерина при помощи аннексина V, но сходное состояние никогда не наблюдали (aннексин V+ и ТМРМ+), все наблюдаемые клетки были либо аннексин V+/ТМРМ-, либо аннексин V-/ТМРМ+ (6, 7). Наблюдаемое на рисунке 1Б состояние тромбоцита не могло быть обнаружено при помощи аннексина V.
Figure 1. Иллюстрация тромбоцитов человека, положительных по лактадгерину, но отрицательных по аннексину V (отмечены стрелками). А – сравнение с аннексин V положительным тромбоцитом. Б – тромбоцит с функционирующими митохондриями (ТМРМ+) и связыванием с лактадгерином (помечен стрелкой). ДИК – дифференциально-интерференционный контраст; Наложение – сумма изображений всех флуоресцентных каналов и проходящего света. Длина масштабного отрезка 10 мкм, n=5.
С учётом этих новых данных, можно описать 3 состояния выхода фосфатидилсерина:
1) совсем нет на поверхности (аннексина V-/лактадгерин-);
2) очень маленький выход на поверхность с сохранением жизнеспособности клетки (аннексин V-/лактадгерин+);
3) максимальный выход фосфатидилсерина (аннексин V+/лактадгерин+), связанный с клеточной смертью и переходом в прокоагулянтную субпопуляцию в её классическом на данный момент представлении. Эти результаты поднимают новые вопросы для будущих исследований физиологии тромбоцитов, например, есть ли тромбоциты с низким выходом фосфатидилсерина в тромбе и каков их вклад в процессы свертывания по сравнению с прокоагулянтной субпопуляцией. Кроме того, в данной работе мы не исследовали активацию тромбоцитов агонистами. Ответы на эти и многие другие вопросы еще предстоит получить.
Конфликт интересов
Конфликт интересов отсутствует.
Вклад авторов
СИО: проведение экспериментов, анализ данных, написание статьи.
Финансирование
Исследование было поддержано грантом Российского научного фонда (РНФ) № 21-75-00109
Благодарности
Автор благодарит Артеменко Е.О. и Глухову А.А. за предоставление меченного аннексина V.
Библиографические ссылки статьи:
REVIEW ARTICLE: Coated-platelets: an emerging component of the procoagulant response
G. DALE
Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2005, 3, 2185-2192
Platelet‐based coagulation: different populations, different functions
J. HEEMSKERK, N. MATTHEIJ, J. COSEMANS
Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2013, 11, 2-16
Procoagulant Platelets Form an α-Granule Protein-covered “Cap” on Their Surface That Promotes Their Attachment to Aggregates
A. Abaeva, M. Canault, Y. Kotova, S. Obydennyy, A. Yakimenko, N. Podoplelova, V. Kolyadko, H. Chambost, A. Mazurov, F. Ataullakhanov, A. Nurden, M. Alessi, M. Panteleev
Journal of Biological Chemistry. 2013, 288, 29621-29632
Binding of Coagulation Factor XIII Zymogen to Activated Platelet Subpopulations: Roles of Integrin αIIbβ3 and Fibrinogen
Y. Kotova, N. Podoplelova, S. Obydennyy, E. Kostanova, A. Ryabykh, A. Demyanova, M. Biriukova, M. Rosenfeld, A. Sokolov, H. Chambost, M. Kumskova, F. Ataullakhanov, M. Alessi, M. Panteleev
Thrombosis and Haemostasis. 2019, 119, 906-915
The role of phospholipids and factor Va in the prothrombinase complex
J Rosing, G Tans, J W Govers-Riemslag, R F Zwaal, H C Hemker
Journal of Biological Chemistry. 1980, 255(1), 274-83
Dynamics of calcium spiking, mitochondrial collapse and phosphatidylserine exposure in platelet subpopulations during activation
S. Obydennyy, A. Sveshnikova, F. Ataullakhanov, M. Panteleev
Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2016, 14, 1867-1881
Mechanisms of increased mitochondria-dependent necrosis in Wiskott-Aldrich syndrome platelets
S. Obydennyi, E. Artemenko, A. Sveshnikova, A. Ignatova, T. Varlamova, S. Gambaryan, G. Lomakina, N. Ugarova, I. Kireev, F. Ataullakhanov, G. Novichkova, A. Maschan, A. Shcherbina, M. Panteleev
Haematologica. 2020, 105, 1095-1106
Clot Contraction Drives the Translocation of Procoagulant Platelets to Thrombus Surface
D. Nechipurenko, N. Receveur, A. Yakimenko, T. Shepelyuk, A. Yakusheva, R. Kerimov, S. Obydennyy, A. Eckly, C. Léon, C. Gachet, E. Grishchuk, F. Ataullakhanov, P. Mangin, M. Panteleev
Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2019, 39, 37-47
Phospholipid binding properties of human placental anticoagulant protein-I, a member of the lipocortin family
Tait J, Gibson D, Fujikawa K.
Journal of Biological Chemistry. 1989, 264(14), 7944-9
Binding of vascular anticoagulant alpha (VAC alpha) to planar phospholipid bilayers
Andree H, Reutelingsperger C, Hauptmann R, Hemker HC, Hermens WT, Willems G.
ournal of Biological Chemistry. 1990, 265(9), 4923-8
Lactadherin binds selectively to membranes containing phosphatidyl-l-serine and increased curvature
J. Shi, C. Heegaard, J. Rasmussen, G. Gilbert
Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 2004, 1667, 82-90
Measurement of phosphatidylserine exposure during storage of platelet concentrates using the novel probe lactadherin: a comparison study with annexin V
A. Albanyan, M. Murphy, J. Rasmussen, C. Heegaard, P. Harrison
Transfusion. 2009, 49, 99-107
Lactadherin and procoagulant activities of red blood cells in cyclosporine induced thrombosis
Zheng Y-n, Yu H-j, Hou J-x, Lu C-f, Zhou J.
Chinese medical journal. 2009, 122(14), 1674-80
Lactadherin blocks thrombosis and hemostasis in vivo: correlation with platelet phosphatidylserine exposure
J. SHI, S. PIPE, J. RASMUSSEN, C. HEEGAARD, G. GILBERT
Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2008, 6, 1167-1174