Математическая модель рецептора 3 типа к инозитол-3-фосфату (IP3R3)

Подъем концентрации свободных ионов кальция ([Са²⁺]) в цитозоле клетки является одним из важнейших путей внутриклеточной сигнализации, регулирующим такие физиологические процессы как экспрессия генов, секреция везикул, изменение формы, пролиферация, дифференцировка и клеточная гибель (1–5). Одним из ключевых событий в кальциевой сигнализации является открытие канала-рецептора к инозитол-1,4,5-трисфосфату (IP₃, IP₃R), находящегося в мембране эндоплазматического ретикулума (внутренняя мембрана, ВМ) и/или на плазматической мембране клетки (ПМ). Через открытые каналы ионы кальция проходят в цитозоль клетки по градиенту концентрации. В клетках возбудимых тканей также присутствует другой канал для ионов кальция – рианодиновый рецептор, принципы работы которого описаны в многочисленных обзорах (6,7). Так как ионы кальция токсичны для клетки, при попадании в цитозоль они сразу «выкачиваются» наружу или «закачиваются» во внутриклеточные хранилища специальными кальциевыми помпами - АТФазами SERCA (sarcoendoplasmic reticulum calcium ­ATPase)(8) и PMCA (plasma membrane calcium ATPase) (9,10). Комбинация каналов и помп для кальция создает характерные временные паттерны кальциевой сигнализации – осцилляции, «кодирующие» внешний сигнал (11).

IP₃R представляет собой семейство больших (гомотетрамер) катионных каналов, преимущественно расположенных в мембране эндоплазматического ретикулума (ЭПР) (12–15). В литературе IP₃R называют как каналом, так и рецептором, однако, в действительности, он представляет собой селективный катионный канал, регулируемый агонистами (12,16,17). Открытие канала управляется концентрацией IP₃ в цитозоле клетки ([IP₃]), а модулируется цитозольной концентрацией ионов кальция ([Са²⁺]). Характер кальциевой модуляции открытия IP₃R зависит от типа рецептора (всего выделяют 3 типа), а также от их пространственного распределения в клетке (18). Одиночные рецепторы способны вызывать лишь небольшое локальное увеличение концентрации кальция в клетке, в то время как обширные кластеры IP₃R приводят к образованию так называемых кальциевых «пуфов», когда ионы Са²⁺, прошедшие через единичные открытые каналы, начинают активировать соседние рецепторы, в результате наблюдается локализованный в пространстве рост [Са²⁺] (19).

В основе способности IP₃R обеспечивать кальциевые осцилляции лежит его бифазная регуляция, осуществляемая ионами кальция (14,16,20). Так, при отсутствии ионов Са²⁺ в среде данный канал является закрытым даже при очень больших [IP₃] (21,22). При увеличении [Са²⁺] наблюдается постепенный рост вероятности открытия рецепторов с последующим выходом на максимум, а при дальнейшем увеличении [Са²⁺] происходит связывание кальция с ингибиторным сайтом и закрытие канала (22). Такой сложный механизм работы может свидетельствовать о наличии у рецептора нескольких сайтов для связывания ионов кальция (20). И, действительно, методами криоэлектронной микроскопии было показано, что в закрытом состоянии каждая субъединица IP₃R связывает два иона кальция – один из них расположен на периферии цитоплазматического домена, в то время как второй принадлежит примембранной области (ПМ). Некоторые исследователи предполагают, что связывание с ионом кальция вызывает поворот ПМ и, как следствие, открытие проводящей поры (12,16).

На сегодняшний день существует довольно большое число математических моделей IP₃R различных типов (23–25), позволяющих имитировать те или иные свойства данного белка в системах кальциевой сигнализации (26–29). Вероятно, одной из наиболее известных является модель De Young - Keizer (20), в которой предполагается, что связывание рецептора с ионом кальция происходит по закону действующих масс, а аффинность к IP₃ при связывании с ионом кальция не изменяется. Альтернативная модель была предложена в работе Sneyd - Dufour (23) для описания кинетики работы IP₃R типа 2. В этой модели также аффинность к IP₃ не зависит от [Са²⁺], однако, афинность ингибиторного сайта к [Са²⁺] зависит от [IP₃].

Сравнительно недавно стало очевидно, что свойства IP₃R определяют скорость прямой передачи кальция из ER в митохондрии и регуляцию активности митохондрий через сайты IP₃R-Grp75-VDAC (30). При этом IP₃R3 рассматривался как маркер контактных сайтов ЭПР-митохондрии (31), хотя в более поздних работах было показано, что ведущую роль в передаче кальция играет IP₃R2 (32). Роль IP₃R3 в кальциевой сигнализации вне митохондриальных сайтов неясна, так как тканей, в которых этот тип является единственным типом кальциевых каналов, неизвестно. Тем не менее на чистых системах было показано, что зависимость вероятности открытия IP₃R3 от [IP₃] носит нелинейный характер (22,33,34) и не может быть описана законом действующих масс, при этом связывание молекул IP₃ и рецептора является кооперативным (33,34). В настоящей работе мы разработали математическую модель кинетики открытия IP₃R3 и показали возможные моды его функционирования в кальциевой сигнализации.

Математическая модель кинетики IP₃R3 представляет собой систему обыкновенных дифференциальных уравнений, построенных на основе модели Sneyd - Dufour (23), состоящей из шести дифференциальных уравнений, каждое из которых отражает возможное состояние одной из четырех субъединиц рецептора (Рис. 1): N - нейтральное состояние готовности к работе; O – открытое состояние, при котором канал обладает ненулевой проводимостью для ионов кальция; A – активированное состояние, при котором проводимость выше, чем в состоянии O; I₁, I₂ – ингибированные состояния, в которых канал закрыт и которые достигаются связыванием иона кальция в ингибиторном сайте; S – закрытое состояние. При отсутствии в среде ионов Са²⁺ и молекул IP₃ субъединица рецептора находится в состоянии N. При связывании иона Са²⁺ происходит переход в ингибированное состояние I₁. Добавление IP₃ в систему вызывает переход из нейтрального состояние N в состояние О. Далее возможны следующие исходы: из состояния О субъединица может перейти в закрытое состояние S (при этом связывание дополнительного кальция не происходит), или же, связав дополнительный ион Ca²⁺ перейти в активированное состояние. При избытке ионов Са²⁺ в среде субъединица из активированного состояния может перейти в ингибированное состояние I₂. Система уравнений оригинальной модели (23) может быть представлена следующим образом:

\begin{equation}\frac{\mathrm d [N]}{\mathrm d t}=-\frac{m_1[Ca^{2+}_{cyt}][N]}{n_1+[Ca^{2+}_{cyt}]}+\phi_2[I_1]-\frac{(m_2+n_2[Ca^{2+}_{cyt}])[N]}{n_1+[Ca^{2+}_{cyt}]}[IP_3]+\frac{(m_{-2}+n_{-2}[Ca^{2+}_{cyt}])[O]}{n_3+[Ca^{2+}_{cyt}]} \tag{1}\end{equation}

В модели (23) предполагается, что вероятность открытия рецептора (Р₀) может быть представлена следующей формулой:

\begin{equation} P_o=(\frac{0.1[O]}{[IP_3R]}+\frac{0.9[A]}{[IP_3R]})^4\tag{7}\end{equation}

где [IP₃R] – общая концентрация всех субъединиц рецептора во всех состояниях: .

Figure 1. Упрощенная схема реакций, лежащих в основе математической модели IP3R3, построенная на основе (23). Из нейтрального состояния (N) субъединица может перейти в открытое состояние (O), связав IP3, или в заингибированное состояние (I1) посредством связывания с ионами кальция (Ca2+). Из открытого состояния субъединица может с течением времени достигнуть закрытого состояния (S) или перейти в активированное состояние (A) при повышении концентрации кальция в цитозоле. Дальнейшее связывание ионов кальция субъединицей рецептора вызывает переход в состояние (I2) и ее инактивацию.

При моделировании кинетики IP₃R3 мы предполагали, что параметры чувствительности ингибиторного сайта (n₁, n₅, φ₆), параметры чувствительности сайта IP₃ к [Са²⁺] (m₂, n₃), время жизни рецептора в закрытом состоянии (φ₄) и параметры чувствительности активаторного сайта (m₄) для IP₃R3 отличаются от IP₃R2, поэтому мы использовали методы подбора параметров для их определения по экспериментальным данным для IP₃R3 (22). Нормированные значения параметров чувствительности приведены в таблице Д4. Кинетические параметры модели были взяты из литературы или оценены на основе существующих литературных данных. Интегрирование системы уравнений проводилось методом LSODA (35). Исследование модели включает в себя поиск стационарных состояний, осуществляемый методом Ньютона (36), а также анализ чувствительности (36–39) и автоматический подбор параметров методом Evolution Strategy (SRES) (40). Все расчеты производились с помощью программного обеспечения COPASI (http://www.copasi.org)(41).

Построение модели IP₃R3

Как было упомянуто ранее, модель IP₃R3 была построена на основе модели Sneyd - Dufour (23). Для корректного описания эффекта кооперативности (33,34) было введено предположение о наличии второго сайта связывания для IP₃ у рецептора и форма зависимости скорости реакции N -> O от [IP₃] была изменена в соответствии с (34) следующим образом:

\begin{equation}J_{N->O}=\frac{m_2+n_2[Ca^{2+}_{cyt}])[N]}{n_1+[Ca^{2+}_{cyt}]}\frac{K_p[IP_3]+3aK_p^2[IP_3]^2+3a^2bK_p^3[IP_3]^3+a^3b^2cK_p^4[IP_3]^4}{1+4K_p[IP_3]+6aK_p^2[IP_3]^2+4a^2bK_p^3[IP_3]^3+a^3b^2cK_p^4[IP_3]^4\tag{8}\end{equation}

где K_p- константа диссоциации IP₃ от второго сайта, а коэффициенты a, b, c являются поправочными факторами и описывают кооперативность (34). Значения параметров приведены в Таблице Д2.

Как было показано ранее, ток через IP₃R может осуществляться, если хотя бы три субъединицы рецептора находятся в открытом состоянии (14,20). Для описания этой возможности, мы модифицировали выражение для вероятности открытия рецептора следующим образом:

\begin{equation}P_0=\frac{\sigma}{\chi}(\frac{0.1[O]}{[IP_3R3]}+\frac{0.9[A]}{[IP_3R3]})^3+\frac{1-\sigma}{\chi}(\frac{0.1[O]}{[IP_3R3]}+\frac{0.9[A]}{[IP_3R3]})^4\tag{9}\end{equation}

где σ – доля тока через каналы с тремя открытыми субъединицами, 𝜘 – нормировочный коэффициент.

Для описания вероятности открытия IP₃R3 в зависимости от [Са²⁺] и [IP₃] (22), мы подбирали параметры модели (отмеченные соответственно в таблице Д2) методом SRES (40) (рис. 2). Параметры, оказывающие наибольшее влияние на результат работы модели, определялись посредством анализа чувствительности. Было обнаружено, что наибольший эффект на вероятность открытия Р₀ оказывают нормировочный коэффициент 𝜘 и параметры, регулирующие скорости переходов в закрытое состояние S (m₃ и φ₄) и открытое состояние А (m₄, m_-4), а также управляющие чувствительностью ингибиторного сайта I₂(n₅). Все результаты анализа чувствительности приведены в таблице Д4. Достоверность полученных значений оценивалась по критерию согласия Пирсона (p-value>0.05, что говорит о малом различии между экспериментальными данными и результатами модели). Как обсуждалось ранее, влияние [Са²⁺] на вероятность открытия канала носит бифазный характер благодаря двум модулирующим сайтам для кальция, и может быть описана колоколообразной функцией с максимумом, зависящим от [IP₃]. В результате расчетов получилось, что зависимость вероятности открытия канала от [IP₃] носит сигмоидальный характер, что соответствует представлениям о кооперативном связывании молекул IP₃ (рис. 2Б).

Для оценки влияния IP₃R3 на кальциевую сигнализацию нами была разработана минимальная математическая модель кальциевой сигнализации (рис. 3). Данная модель представляет собой систему из семи независимых дифференциальных уравнений, описывающих концентрацию ионов кальция в цитозоле ([Ca²⁺_cyt]) и в ЭПР ([Ca²⁺_er]) клетки и указанные выше шесть состояний рецептора. В состоянии покоя [IP₃] = 0 мкМ, [ Ca²⁺_cyt] = 0 мкМ в отсутствие тока утечки. При активации клетки происходит повышение [IP₃], что приводит к выходу кальция из ЭПР и развитию кальциевого ответа системы. В рамках данной модели мы не рассматриваем обмен ионами кальция с внешней средой. В дополнение к уравнениям (1)-(9) в модель вводится следующее уравнение:

Figure 2. Расчетные зависимости вероятности открытия IP3R3 в стационарном состоянии от [Са2+] (А) и [IP3] (Б). Параметры модели, подобранные по экспериментальным данным (A, (22)): n1=3,10 мкМ, m2=1056,85 мкМ*с-1, n3=40,30 мкМ, φ4=7,45 с-1, n5=999,97 мкМ, φ6=27,89 с-1, σ=0,009, 𝜘=0,67.

\begin{equation}\frac{\mathrm d[Ca^{2+}_{cyt}]}{\mathrm d t}=\beta(Y_{IP3R}P_0[IP_3R3]ln(\frac{[Ca^{2+}_{er}]}{[Ca^{2+}_{cyt}]})+\gamma_{leak}ln(\frac{[Ca^{2+}_{er}]}{[Ca^{2+}_{cyt}]})-\frac{V_{serca}[Ca^{2+}_{cyt}]^n}{K_{serca}^n+[Ca^{2+}_{cyt}]^n})\tag{10}\end{equation}

где β-отношение объемов двух компартментов (ЭПР и цитозоля); Y_IP3R - проводимость IP₃R3 для кальция; Р₀ - вероятность открытия IP₃R3, полученная из уравнения (9); γ_leak - ток утечки ионов Са²⁺ из ЭПР в цитозоль; V_serca - активность SERCA; K_serca - константа полуактивации SERCA; n- коэффициент кооперативности для SERCA;  =  - концентрация ионов кальция в ЭПР. Значения параметров приведены в Таблице Д3.

Figure 3. Схема модели кальциевой сигнализации (10)-(11). При активации клетки происходит повышение концентрации инозитол-1,4,5-трисфосфата (IP3) в цитозоле клетки (обозначен розовым). IP3 инициирует открытие канала-рецептора IP3R типа 3 в мембране ЭПР (обозначен синим), что приводит к выходу ионов кальция (зеленый кружок, Ca2+) из ЭПР в цитозоль. Кальциевая АТФаза (SERCA) катализирует обратный ток ионов Ca2+ из цитозоля в ЭПР. Голубой прямоугольник обозначает спонтанную утечку кальция из ЭПР в цитозоль.

Результаты численного интегрирования модели при различных [IP₃] представлены на рисунке 4. Кальциевый ответ клетки на различный уровень активации носит триггерный характер: при малых [IP₃] уровень Са²⁺ изменяется слабо (в пределах 10 нМ), однако при достижении пороговых значений [IP₃] наблюдается резкий скачок Са²⁺ и выход на стационарное состояние, определяемое суммарным количеством кальция в системе, но не [IP₃]. Зависимость динамики [Ca²⁺] от [IP₃] наблюдается только в узком диапазоне концентраций (рис. 4Б).

В кальциевой сигнализации утечка кальция из ЭПР играет роль трения в колебательной системе и сужает диапазон параметров, при которых наблюдается осцилляторный ответ (26). Как видно из рисунка 4, добавление в систему тока утечки (γ_leak) позволяет увеличить чувствительность системы к активатору, а также расширить диапазон, при котором уровень кальция в цитозоле зависит от [IP₃]. Благодаря утечке ионов из ЭПР постоянный уровень кальция в покое поддерживается постоянным (≈100 нМ) независимо от количества активатора. Если же дополнительный поток Са²⁺ отсутствует, уровень цитозольного кальция может быть заметно снижен.

Figure 4. Результаты численного интегрирования модели кальциевой сигнализации (1)-(10). Симуляция зависимости [Ca2+] от времени в отсутствие (А) и в присутствии (В) тока утечки ионов кальция через мембрану ЭПР (γleak). Зависимость [Ca2+] при t = 2000 с от [IP3] в отсутствие (Б) и в присутствии (Г) тока утечки ионов кальция через мембрану ЭПР (γleak). Расчеты проводились при следующих параметрах: β=0,1, Vserca=60000 мкМ/с, Kserca=0,27 мкМ, n=1,7, YIP3=4,2∙105 с-1, [IP3R3] = 0,5 мкМ, Cae = 500 мкМ.

Для того, чтобы определить возможные варианты кальциевого ответа, которые могут наблюдаться в системе с IP₃R3, в широком диапазоне варьировались такие параметры модели, как отношение объемов цитозоля и ЭПР - β, активность SERCA - V_serca, концентрация кальция в ЭПР – Са²⁺_er, а также количество самих IP₃-рецепторов – IP₃R3 (рис. 5). Тем не менее, путем изменения всех приведенных величин в данной системе не удалось наблюдать осцилляции [Са²⁺]. В то же время, при низких значениях [IP₃] влияние V_serca не является монотонным (рис. 5А), а именно, при активности SERCA порядка единиц мкМ/с уровень кальция через 2000 с не превышает 1мкМ, в то время как при V_serca≈10-100мкМ/с [Са²⁺] достигает 40 мкМ для больших концентраций IP₃. Данный эффект связан с возникновением одиночного кальциевого пика при малой активности SERCA. Чем приведенная величина меньше, тем короче продолжительность подъема [Са²⁺]. При активности SERCA V_serca≈6мкМ/с ширина кальциевого пика может составлять не более 3000 с. С ростом активности SERCA характерные времена могут быть увеличены до 5000 с и более (рис. Д1).

[fig_5]

В рамках данной работы впервые разработана математическая модель, описывающая кинетику работы рецептора 3 типа к инозитол-1,4,5-трисфосфату. Данная модель учитывает не только бифазную регуляцию открытия рецептора, осуществляемую ионами Са²⁺, но и нелинейный характер зависимости вероятности открытия рецептора от концентрации IP₃. Полученные результаты согласуются с существующими литературными данными (22).

При численном интегрировании минимальной модели кальциевой сигнализации, обеспечиваемой IP₃R3, в системе не было обнаружено осцилляторного режима. Это противоречит существующему в литературе представлению о том, что «колоколообразная» форма зависимости вероятности открытия канала от концентрации кальция обеспечивает осцилляции в системе (11). С другой стороны, в работах J. Keizer ранее было показано, что в процессе осцилляций поведение рецептора в стационарном состоянии играет менее важную роль, нежели его ответ на изменения уровня кальция в цитозоле (24,42). Стоит отметить, что существование кальциевых осцилляций в клетке не всегда определяется работой непосредственно IP₃-рецепторов. Данное поведение системы может быть вызвано широким кругом факторов, включающих активность кальциевых АТФ-аз, обмен кальцием с внешней среды, колебания концентрации IP₃, а также другие специфические кальциевые каналы (например, рианодиновый рецептор -RyR)(24). Наилучшим способом оценить вклад того или иного типа рецепторов в возникновение осцилляций в системе можно, если последовательно «выключать» каждый рецептор. Так, экспериментально было показано, что удаление IP₃-рецептора 3 типа усиливает осцилляции (частота осцилляций увеличивается, появляется возможность детектировать отдельные пики) при разных концентрациях активатора, в качестве которого использовался АДФ (43). Вклад IP₃-рецепторов 3 типа исследовался на разных клетках (Hela, COS-7), обладающих различным уровнем экспресии данного белка. Опираясь на полученные данные, можно предположить, что данный канал выполняет анти-осцилляторную функцию (43). Влияние разных подтипов IP₃-рецепторов исследовалось и на клетках линии CHO (31). В присутствии всех трех типов каналов в большинстве клеток (более 80%) возникают устойчивые кальциевые осцилляции в ответ на АДФ, выход на плато или кратковременный кальциевый пик наблюдаются довольно редко (менее 10%). При «выключении» канала 3 типа возрастает доля клеток, в которых уровень кальция, напротив, выходит на плато (более 25%) или осциллирует (68%). К сожалению, данная работа не позволяет однозначно судить о роли рецептора 3 типа в кальциевой сигнализации, поскольку начальный уровень экспрессии рецепторов в клетке изначально достаточно сильно различался, а концентрация активатора не варьировалась (31). Тем не менее, стоит отметить, что при нокауте именно рецепторов 3 типа доля клеток, отвечающих на АДФ посредством осцилляций кальция была наибольшей по сравнению с нокаутами других типов рецепторов (31). Данное наблюдение может говорить о том, что при заданных условиях (концентрация АДФ, уровень производимого IP₃, общее количество рецепторов) каналы 3 типа вносят наименьший вклад в возникновение и поддержание колебаний в системе. При анализе влияния рецептора в том или ином типе клеток не стоит забывать про видовую специфичность и возможные различия в механизмах работы белков у представителей разных видов.

Отсутствие осцилляций в системе с разработанной моделью рецептора 3 типа может быть вызвано тем, что Са-зависимое ингибирование рецептора происходит при очень высоких концентрациях кальция в цитозоле (10-1000 мкМ). Кроме того, открытие рецептора требует очень малых концентраций активатора. Можно предположить, что при физиологических значениях IP₃ (10 нМ-1.8 мкМ) (44) рецептор 3 типа всегда находится в открытом состоянии и позволяет поддержать постоянную концентрацию цитозольного кальция в покоящемся состоянии клетки. В целом, результаты настоящей работы соответствуют предположению, что IP₃R3 «настроены» для переноса кальция в митохондрии в местах контактов ЭПР-митохондрия, где могут наблюдаться очень высокие концентрации кальция и нет необходимости в осцилляторном режиме.

Следует отметить, что в построенной модели присутствует ряд ограничений. Так, здесь не учитывается зависимость активности рецептора от уровня АТФ (21,45). Данный фактор может не сильно повлиять на моделирование кальциевой сигнализации клеток с участием IP₃-рецептора 3 типа, поскольку в них зачастую не рассматривается изменение концентрации АТФ. Тем не менее, отсутствие зависимости от данного параметра ограничивает возможности использования экспериментальных данных для валидации модели, если они получены при различных условиях.

Финансирование: Работа поддержана грантом РНФ 23-44-00082

Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.